苏云金芽孢杆菌噬菌体MZTP02c基因组文库的构建及保藏研究
本文通过用丝裂霉素C(MMC)诱导苏云金芽孢杆菌溶原性生产菌株MZ1-H3ab，从裂解液中分离到一株基因组大小约为40 kb的温和噬菌体MZTP02末端突变株MZTP02c。运用构建酶切片段质粒文库和PCR的方法，构建了一个覆盖该突变体基因组95％以上遗传信息的DNA文库，并进行了生物信息学分析。由于实验过程中发现噬菌体MZTP02c的滴度(titer)下降十分迅速，因此同时研究了不同温度下MZTP02c混合甘油、DMSO、氯仿等稳定剂时活力保持情况。
通过9轮空斑纯化MMC诱导MZ1-H3ab释放的噬菌体，得到一株生物学性状一致的噬菌体。由子MZ1-H3ab可能含有2株噬菌体，MZTP01和MZTP02.因此分别用MZTP02和MZTP01的特异基因tmp、mur、pep和ogr进行PCR鉴定，结果显示特异扩增条带序列和tmp、mur完全一致，因此推测所得到的噬菌体可能来源于MZTP02，并命名为MZTP02c。SDS—PAGE分析MZTP02c结构蛋白组成，结果显示只有4个条带与MZTP02一致。MZTP02c结构蛋白组成大致为：34 kDa和37 kDa两条主带，24 kDa、26 kDa和28 kDa三条次主带，49 kDa、55kDa、70 kDa和85 kDa四条次带。继而进行的基因组DNA酶切图谱分析也显示出MZTP02c在基因组大小和DNA序列上与MZTP02有极大的差异。
将基因组酶切片段克隆到载体上，构建了含有14个酶切片段的质粒文库。运用DNASATR和DNAMAN生物软件拼接后，得到了26 kb、SphI/BamHI—4 kb、XbaI—3 kb和BamHI/EcoRI-1.5 kb四个独立的片段，总计约35 kb。运用DNASTAR MEGLINE软件进行比对，发现MZTP02c和MZTP02 DNA序列的42 bp～15313 bp完全相同，但是MZTP02c在5’端和3’端继续向2个方向延伸了大约20 kb。
再通过在四个独立片段两端设计引物，两两之间进行PCR扩增连接。最后文库序列拼接得到MZTP02c30，054 bp主体片段，1586 bp和3342 bp2个未拼接的酶切片段以及2485 bp、899 bp和725 bp三个单端特异PCR扩增片段。一共涵盖MZTP02c DNA信息38.782 kb。
生物信息学分析显示，MZTP02c基因组文库DNA序列GC含量为36.31％．BLASTN同源序列联配比较表明，MZTP02c和三个蜡状芽孢杆菌B．cereus G9842(27％)，B．cereus B4264(27％)以及B．cereusATCC14579(19％)基因组同源性最大。而较噬菌体基因组而言，Bacillus phage IEBH(4％)和Bacillus anthracis pbage Gamma isolate53(3％)是与MZTP02c同源性相对高的2个噬菌体。
应用生物信息学软件预测文库DNA序列包含53个ORFs，7个启动子，向正反两个方向进行转录，其中17个ORFs含有蛋白保守区域。MZTP02c基因组结构可分为五个功能模块，从5’到3’依次为：DNA复制、转录控制、DNA包装、噬菌体粒子装配和细胞裂解。可能与噬菌体溶原性相关的蛋白主要有，DNA复制终止蛋白、DNA修复ATPase、dUTPase、RNA聚合酶组分以及DNA聚合酶DnaD组分等。
为了研究MZTP02c的最佳保藏方法，把从平板上收集的噬菌体悬液进行简单的离心分离纯化，再加入25％甘油、7％DMSO或1％氯仿作为保藏稳定剂，在4℃、—20℃和—80℃下进行正交保藏实验。同时尝试将噬菌体和敏感宿主H25在37℃温浴吸附后再加入稳定剂的保藏方法。结果显示在—80℃条件下，采用7％DMSO作稳定剂，同时使噬菌体MZTP02c预先和宿主细胞吸附的保存方法效果良好，可使MZTP02c一年之内滴度下降幅度从初始4℃保藏下降107 PFU/ml优化到一年只下降3×102 PFU/ml。
苏云金芽孢杆菌;丝裂霉素C;噬菌体基因;杀虫微生物;分离纯化;基因文库;生物信息学分析
中山大学
硕士
微生物学
庞义
2009
中文
S767.32
89
2009-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）