β-半乳糖苷酶基因tt412的原核表达、酶学性质研究及分子改造
本论文在此基础上，将基因tt412插入pET—32a(+)上构建表达载体pET—tt412，转化到大肠杆菌E．coli BL21(DE3)。通过诱导条件的优化，得出在25℃，IPTG终浓度为0.75 mM，表达时间为6h的条件下，目的蛋白的表达量达到最大，约为0.2 mg/ml。
乳糖酶基因tt412的表达产物约为77.3 kDa，该酶最适反应温度为46℃，在56-60℃下处理2 min，几乎检测不到酶活力，表明该酶热稳定性较差；在pH7.0，即天然牛乳的pH值，该酶水解活力最高，在pH6-9之间酶活力维持在80％以上：Na+、K+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+对酶活性影响不大，Cu2+对酶活力有较强的抑制作用；在0-30 mM浓度范围内，Ca2+几乎不影响酶的活性。以ONPG为底物，Km值为0.567 nmol/L，Vmax值为8.834nmol/min：以乳糖为底物，Km值为94.43 nmol/L，Vmax值为312.5 nmol/min。
尽管乳糖酶基因tt412在原核表达系统中实现了高效表达，并且以ONPG为底物时其酶活性高达106 U/ml；可是以乳糖为底物时酶活性只有0.97U/ml，这给它在食品工业中的应用带来了困难。为了提高乳糖酶TT412对乳糖的降解能力，我们对克隆的乳糖酶基因tt412进行分子改造。通过同源建模分析，在基因上选取了三个与酶活性相关的位点(D282、W316、TLNV42)进行定点突变，然后对突变子进行酶活性分析。实验结果表明，在D282位点的三种不同氨基酸突变都没有产生可溶性的酶蛋白；在W316位点的三种不同氨基酸突变酶的活性反而比野生型的低；只有在TLNV42位点发生突变的酶活力明显提高，以乳糖为底物的酶活性提高了47.4％。本研究为今后进一步研究和改造乳糖酶，并进行工业化生产奠定了一定的基础。
β-半乳糖苷酶;原核表达;乳糖酶基因;基因表达;酶学性质;定点突变
中山大学
硕士
微生物学
刘玉焕
2009
中文
Q556;Q934.3
76
2009-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）