结核特异性TCR四聚体及抗结核菌海洋微生物代谢产物的鉴定筛选
研究背景和目的:
结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的严重危害人类健康的以呼吸道系统为主的慢性传染病。随着卡介苗（M bovis Bacille Calmette—Guerin，BCG）的普遍接种，结核病的发病率曾一度呈下降趋势，但由于卡介苗不能使机体获得终生免疫，结核杆菌多重耐药菌株及人体免疫缺陷病毒双重感染的出现，使结核病的发病率和死亡率呈上升趋势。全世界有三分之一的人感染MTB，其中5％～10％的感染者发展成为活动性结核病，是否发病不仅与侵入机体的细菌数量和毒力等因素有关，还与机体的免疫功能有关。
结核病的治疗以化学药物治疗为主。目前，一线抗结核药有异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、卡那霉素、卷曲霉素、丁胺卡那、环丙沙星、莫西沙星、加替沙星等。但自60年代后期利福平上市后，全球范围内仅批准了利福布丁和利福喷丁两个新药治疗肺结核。对比结核病耐药情况的日益严重，开发新的强效抗结核菌药物具有重要意义。海洋是地球早期生命的诞生地，环境独特，具有高压、高盐、低营养、低温、无光照以及局部高温等特点。海洋生物为适应这种独特环境，在长期的进化过程中，形成了独特而多样的代谢途径，造就了种类繁多、结构奇特、活性强，与陆生天然活性物质不同的代谢产物，成为新的强效活性药物的宝库。海洋微生物具有独特的代谢方式，可提供陆地微生物中未遇到的代谢产物，是研究和增加新颖化合物的热点。在对海洋微生物的研究中，也找到了结构多样性的抗结核菌及其其他分枝杆菌活性的代谢产物，包括有肽类化合物，生物碱类化合物，萜类化合物等。
MTB为胞内寄生菌，故机体的抗结核免疫主要依靠T细胞为主的细胞免疫，T细胞通过T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别抗原，识别过程受主要组织相容性（抗原）复合物（major histocompability complex，MHC）的限制。MTB感染机体后，抗原递呈细胞（antigen present cells，APCs）对其进行加工处理，与APCs表面的人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）形成HLA/肽复合物，TCR特异性识别HLA/肽复合物，进而介导一系列的免疫反应。因此，TCR与HLA/肽的特异性相互作用可用于抗原特异性T细胞的检测。但是HLA/肽单体虽然能与TCR结合，但亲和力低，解离速度快，而不能直接用来检测抗原特异性T细胞。文献报道，通过将单体多聚化可提高相互作用的分子间的亲和力，从而降低解离速度。多聚体形式的MHC—肽复合物可与同一个细胞表面的多个TCR结合，因此可以提高两者间的亲和力。Altman等于1996年创建了可溶性MHC/肽四聚体技术，将复合物单体四聚化，从而大大提高了MHC/肽复合物与TCR的亲和力和稳定性，使这一难题得到解决。
四聚体技术是一种可以直接对抗原特异性T淋巴细胞进行标记的新方法。目前，MHCclassⅠ和MHCclassⅡ四聚体已经被用来深入研究发现和定量抗原特异性T细胞，并且用来探索TCR与MHC之间的相互作用。反之，TCR四聚体也可用来研究TCR与MHC之间的相互作用并有利于新的免疫疗法及疫苗的研究。目前未有实验室利用结核特异性的TCRα和β链构建的四聚体来分析结核特异性多肽-MHC复合体。但是初步制备成的四聚体是否为MTB特异性CD4+α/βTCR四聚体、亲和力如何，众多的α链与β链的分别配对组合是否适合并未可知，因此构建细胞膜上表达结核抗原肽/HLADR复合物的S2细胞株，用流式细胞仪分析，可解决上述问题。
本实验的目的是：1．构建细胞膜上表达结核抗原肽/HLADR复合物的S2细胞株，并用来鉴定MTB特异性CD4+α/βTCR四聚体；2．对筛选出的MTB特异性CD4+α/βTCR四聚体进行初步功能研究；3．筛选抗结核菌海洋微生物代谢产物（单体化合物及合成衍生物）。
研究内容和方法:1．将含有HLADRβ链和加载有结核抗原肽的HLADRα链全长基因的表达载体pMT—HLADRB及pMT—HLADRA—P，磷酸钙转染法转入果蝇S2细胞中进行表达配对，构建膜表达结核抗原肽/HLADR复合物的S2细胞株，并应用细胞免疫组化法及流式细胞术进行鉴定。
2．将能共表达CD4+α/βTCR双链单体和生物素化酶的恒定细胞株大量培养，以组氨酸亲和层析柱纯化目的蛋白TCRα/β双链单体，并经WesternBlotting鉴定目的蛋白。按8：1比例将纯化的TCRα/β双链单体与链霉亲和素—PE初步制备成四聚体。
3．将膜上表达结核抗原肽/HLADR复合物的稳定S2细胞株和α/βTCR四聚体，用流式细胞仪分析，筛选MTB特异性CD4+α/βTCR四聚体。
4．用K—B法及绝对浓度法的间接法对海洋微生物代谢产物（单体化合物及合成衍生物）进行抗结核菌筛选及最低抑菌浓度测定。
结果:
1．将含有HLADRβ链和加载有结核抗原肽的HLADRα链全长基因的表达载体pMT—HLADRB及pMT—HLADRA—P，磷酸钙转染法转入果蝇S2细胞中，构建膜表达结核抗原肽/HLADR复合物的S2细胞株。细胞免疫组化法及流式细胞术鉴定显示获得18株细胞膜上表达结核抗原肽/HLADR复合物的稳定S2细胞株。
2．将膜上表达结核抗原肽/HLADR复合物的稳定S2细胞株和α/βTCR四聚体，用流式细胞仪分析，结果显示筛选出MTB特异性CD4+α/βTCR四聚体。
3．用K—B法及绝对浓度法的间接法对海洋微生物代谢产物进行抗结核菌筛选，初步筛选出具有抗结核菌活性的海洋微生物代谢产物（单体化合物及合成衍生物）。
结论:
1．获得18株稳定表达跨膜HLADR/MTB肽复合物单体的恒定果蝇S2细胞株，可作为APC用于CD4+TCR四聚体的α和β链最佳配对检测和鉴定MTB特异性CD4+α/βTCR四聚体。
2．成功获得6种MTB特异性CD4+α/βTCR四聚体，为探索开发结核诊断新方法及新型结核疫苗提供了有利工具。
3．成功筛选出具有抗结核菌活性的海洋微生物代谢产物（单体化合物及合成衍生物），为进一步开发新的抗结核菌活性先导化合物奠定了基础。
结核病;结核分枝杆菌;海洋微生物;抗结核菌筛选;细胞免疫
中山大学
硕士
微生物学
赖小敏
2009
中文
R520.1;Q176
65
2009-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）