带组氨酸标签的登革病毒2型和4型病毒样颗粒的表达鉴定和纯化
研究目的：
1.扩增编码登革病毒2型和4型结构蛋白prM和E全基因组序列，构建登革病毒样颗粒重组表达载体，使其在毕氏酵母中大量表达病毒样颗粒，通过亲和层析和蔗糖密度梯度离心方法获得高纯度的VLPs，为研制登革病毒样颗粒疫苗奠定基础。
2.分析比较亲和层析和蔗糖密度梯度离心两种VLPs纯化方法的优缺点，为获得大量登革病毒样颗粒提供实验依据。
研究方法:
1.登革病毒2型VLPs的表达和初步鉴定用设计的特异引物从DENV2prM和E全基因组cDNA中PCR扩增SprME基因，用限制性内切酶Bsp1191和XbaI分别切割空载体pGAPZαA质粒和上述PCR产物，然后在T4连接酶的作用下将SprME基因和空载体pGAPZαA质粒连接成重组质粒，转化入DH5α大肠杆菌内，用PCR、酶切及序列测定的方法鉴定插入表达质粒中的SprME基因序列准确无误后，线性化重组质粒通过电转化的方法把重组质粒转化入酵母细胞中，对发酵上清和细胞裂解液分别进行SDS—PAGE和Western blotting检测目的蛋白。
2.登革病毒4型VLPs的表达和初步鉴定用设计的特异引物从T/A克隆质粒中PCR扩增prME基因，用限制性内切酶XhoI和XbaI分别切割空载体pGAPZαA质粒和上述PCR产物，然后在T4连接酶的作用下将prME基因和空载体pGAPZαA质粒连接成重组质粒，转化入大肠杆菌DH5α内，用PCR、酶切及序列测定的方法鉴定插入表达质粒中的prME基因序列准确无误后，用AvrⅡ内切酶线性化重组质粒通过电转化的方法把重组质粒转化入酵母细胞中。对发酵上清和细胞裂解液进行SDS—PAGE检测目的蛋白，利用蔗糖梯度离心的方法从细胞裂解液中分离纯化VLPs，并通过负染电镜观察VLPs。
3.亲和层析和蔗糖密度梯度离心纯化蛋白的比较分别利用亲和层析和蔗糖密度梯度离心的方法对浓缩的上清液进行纯化，对纯化蛋白进行SDS—PAGE和Westernblotting检测鉴定。然后测定两种纯化方法获得蛋白的量，进行统计学分析，结合各自优缺点，对两种纯化蛋白的方法进行评价。
研究结果:
1.成功构建含prM信号肽的pGAPA—SprMED2-HIS和载体α信号肽的pGAPαA—prMED4-HIS两种重组表达质粒。
2.重组质粒pGAPA—SprMED2-HIS电转化入酵母细胞后，通过SDS—PAGE和Westernblotting在酵母细胞裂解液和发酵上清中分别检测到大小约52kDa的目的蛋白条带。
3.重组质粒pGAPZαA—prMED4-HIS电转化入酵母细胞后，通过SDS—PAGE在酵母细胞裂解液和发酵上清中检测到约52kDa的目的蛋白条带。在裂解液中观察到直径30nm的病毒样颗粒。
4.通过亲和层析和蔗糖密度梯度离心两种方法纯化酵母上清DENV2VLPs，运用统计学软件对两种方法获得蛋白量的分析，结果表明两种方法无明显差异。
结论:
1.成功构建能表达登革病毒2型和4型病毒样颗粒的重组载体。
2.在信号肽的引导下，成功实现登革病毒2型和4型病毒样颗粒在毕氏酵母上清中的分泌性表达。
3.通过亲和层析和蔗糖密度梯度离心两种方法纯化含DENV2VLPs酵母细胞上清，比较两种方法获得蛋白量无明显差异，但Ni—NTA离子柱亲和层析其操作过程相对简单，可视为获得登革病毒样颗粒一种备选纯化方法。
登革病毒2型;扩增编码;结构蛋白prM;全基因组序列;颗粒疫苗;亲和层析;VLPs纯化
中山大学
硕士
微生物学
江丽芳
2009
中文
R373.33;R392.7
53
2009-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）