莱氏野村菌Nomuraea rileyi几丁质酶基因的克隆、表达与分析
莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)是一种重要昆虫病原真菌，可以感染许多重要的害虫如棉铃虫(Helicoverpa armigera)，斜纹夜蛾(Spodoptera litura)，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等，并在田间引发多种害虫病害流行病，在生物防治及害虫综合治理(IPM)中有很大的应用潜力。二十世纪七十年代到现在国内外对Nomuraea rileyi的研究集中在三个方面：生物学、生物防治及遗传多样性分析。但目前为止国内尚未涉及侵染宿主分子机制的研究。
昆虫病原真菌在穿透寄主体壁的过程中会产生多种水解酶例如蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶。而昆虫体表几丁质约占30％，构成了昆虫病原真菌入侵主要障碍。因此几丁质酶在侵染阶段起着至关重要的作用。Nomuraea rileyi Cq菌株为本实验室分离，先后对其生物学、生态学及最适产几丁质酶的发酵条件做了研究。本实验对Nomuraea rileyi Cq菌株几丁质酶基因进行了克隆，与其它昆虫病原真菌几丁质酶基因进行了比较分析，并将该基因转入酵母细胞中，进行了表达和特性分析。
实验结果如下：
1．实验采用CTAB法提取Nomuraea rileyi菌丝基因组，利用Primer5.0设计不同阶段引物进行多次PCR，得到了长度为2756bp的含有几丁质酶基因的序列(GenBbank登录号为EU795711)，几丁质酶基因开放阅读框(ORF)1511bp，其中包含3个内含子，编码424个氨基酸。Nomuraea rileyi Cq菌株与国外Nomuraea rileyi MJ菌株几丁质酶基因编码的氨基酸(AAP04616)序列相似性达99％，但在4个不同的位点存在四个氨基酸的差异，同时信号肽剪切位点、分子量、等电点、蛋白质二级结构也存在差异；Nomuraea rileyi Cq菌株与其它病原真菌 Metarhizium flavoviride(CAB44709)、Hypocrea lixii(BAB40589)、Lecanicilliumlecanii(ABD77096)、Isaria farinose(ABD64606)、Stachybotrys elegans(AAM70478)、Beauveriabassiana(AAN41260)几丁质酶氨基酸序列的相似性分别为79％、74％、74％、74％、69％、64％。
2．将构建的pPIC9K—chit1表达载体线性化后，电击转化进毕赤酵母中，采用浓度为1.5mg/mL的G418平板筛选，然后对优势菌落进一步采用PCR验证。对验证正确的菌落进行发酵培养。收集24h、48h、72h诱导产几丁质酶的发酵液，分别做透明圈验证几丁质酶存在的实验，结果48h和72h均出现透明圈，而72h的透明圈最明显；测其0h、24h、48h、72h发酵液中酶的活性，结果72h酶活性出现最高值：最后采用TCA法沉淀48h和72h发酵液中蛋白质，将处理的蛋白质进行SDS—PAGE电泳，由于酵母自身几乎没有分泌外源蛋白，所以经SDS—PAGE电泳显示的蛋白条带估算分子量为41kDa，且与预测蛋白分子量大小相当，确定该蛋白为目的蛋白几丁质酶。
莱氏野村菌;几丁质酶;基因克隆;基因表达
西南大学
硕士
微生物学
万永继
2009
中文
Q949.32
51
2009-08-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）