抗生素作为信号分子对铜绿假单胞菌中致病因子调节机理的研究
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种机会致病菌，它可以在人群中引起严重的急性和慢性感染，是病人在医院期间发生感染的第三大致病菌。许多抗生素对其有一定的治疗作用，但铜绿假单胞菌有一个重要特性是它对许多抗生素具有很高的内在抗药性。因此研究哦铜绿家担保久的抗药性激励、研究其致病性肌和开发新的抗铜绿假单胞菌药物是当前微生物学和医学的一个重要课题。
一、微生物在生长过程中分泌许多次级代谢产物，吩嗪作为其代谢产物中的一类，除在传统意义上作为一种抗生素及致病因子外，最近的研究表明，吩嗪中的许多衍生物(如：pyocyanin)还能作为一种信号分子，对许多基因的表达具有明显的调节作用。基于吩嗪在微生物生命活动中的重要性，在基因水平上研究了吩嗪合成基因的调节机理。对phzA1B1C1D1E1F1G1(phzA1)启动子的具体结构进行了研究并对该操纵子受其自身产物反馈调节进行了探索。结果表明：
1.吩嗪合成操纵子phzA1的启动子区域结构极为复杂，含有两个las—box，是群体感应系统(Quorum—Sensing Systems)对其调节的调节蛋白结合位点：通过基因缺失，将不同长度启动子区域DNA片断与带luxCDABE的报道质粒pMS402相连，检测表达活性，确定了其调节部位，证实启动子域上的第一个las—box(翻译起始位点上游326 bp)是其QS调节所必需，同时也是启动本身活性所必需的；
2.通过对吩嗪合成phzA1操纵子中基因phzA1、phzC1和phzE1分别进行敲除，发现吩嗪终产物绿脓菌素( pyocyanin)产量几乎消失。而构建好的phzA1启动子—luxCEABE为报道子的融合体Mini—CTX—phzA1在这些突变体的表达却显著增强，这说明phzA1受其自身产物吩嗪的负调节。
3.由于吩嗪产物与群体感应系统具有密切的调控关系，而且研究表明绿脓菌素是QS的终极信号分子，我们推测群体感应系统可能也受吩嗪产物的调节。因此，我们测定了群体感应系统基因(las， rhl以及pqs)在phzA1突变体中的表达水平，lasR和rhlI在phzA1突变体中的表达提高约3倍，而其它表达融合体没有明显区别。结果说明吩嗪自身的合成受到群体感应系统调节外，它作为一种信号分子，反过来对群体感应系统具有反馈调节作用。
二、抗生素作为自然界中一部分菌体分泌出来的一种化学物，它除传统的杀菌或抑菌外，还表现出了其它的一些活性。在低于最小抑制浓度(Minimal Inlubitory Concentration，MIC)条件下，它作为一种化学信号物对许多基因的表达起着重要的调节作用。研究低于最小抑制浓度抗生素将有助于我们更好的了解病原菌的致病性和耐药性，从而找到细菌对抗生素的耐药靶点。在本实验中，研究了低于抑制浓度的抗生素对基因表达调节的具体机理。结果表明：
(1)低于抑制浓度抗生素对铜绿假单胞菌中致病因子库中的许多致病因子具有调节作用。如：吩嗪合成基因操纵子phzA1受到低于抑制浓度四环素的强烈激活作用。
(2)为了更好地了解基因表达受抗生素调节的具体途径，我们通过转座突变的方法，以受四环素(Tetracycline)调节的吩嗪合成基因操纵子phzA1为研究对象，找到了12个负调节基因，这些基因能使四环素对phzA1的调节程度降低；18个正调节基因，它们促使四环素对phzA1的调节程度提高；更重要的是，PA1196和PA0487基因发生突变后，phzA1不再受四环素的调节；这些结果对于抗生素在低于抑制浓度条件下，作为一种信号分子对基因表达调节机制的理解，提供了非常重要的理论基础。
(3)由于吩嗪的合成受到群体感应系统的严格控制，上述筛选到的影响吩嗪合成的突变体可能和群体感应系统之间存在着某些联系。为了验证这种假设，检测了群体感应系统基因在这些突变体中的表达水平。结果发现了数个调节基因的调控途径，如：PA0964(PmpR)基因对细菌群体感应系统(Quorum—Sensing Systems)具有明显的调节作用。
(4)为了进一步确定PA0964是直接还是间接调节群体感应系统，在体外表达蛋白(PA0964)，通过EMSA实验表明，它通过直接结合在pqsR上来调节其它致病因子的表达。PA0964属于成员数目庞大的功能未知基因家族(yebC家族)，揭示了一个新的群体感应系统的调节途径，同时为研究整个yebC家族基因的功能提供了一个经实验验证的线索。
群体感应系统在细菌致病性的调控方面起到重要作用，包括生物膜的形成、毒素的产生、侵染的过程等。近年来的研究表明，干扰细菌的QS系统可以作为潜在的防治细菌病害的新途径。该途径主要是以群体感应调控蛋白间的竞争和降解自体诱导物的方式对目标菌株进行信号干扰(Quorum quenching)，从而降低致病菌的致病能力来达到控制病原菌感染的目的。
三、通过转座突变的方法，筛选了一些对吩嗪合成基因phzA1有调节的突变体。在这些突变体中，有一个突变体的表型发生了很大的变化，在固体和液体培养基中培养时，其颜色由原来的绿色变成了白色。我们通过随机PCR和测序，确定转座子插入在PA2593基因的启动子区域。鉴于该突变体以上的表型及其特征变化，我们在后续的实验中进一步研究了该突变体的特性以及该基因的功能，结果表明：
1.在铜绿假单胞菌中过量表达该基因，和转座插入突变一样，铜绿假单胞菌在固体和液体培养基中培养时，其颜色发生了明显的变化，吩嗪产量明显降低；
2.由于吩嗪的合成受群体感应系统的严格控制，于是我们检测了群体感应系统中的信号分子的量(C4—HSL和C12-HSL)，两者的量也明显减少；同时，群体感应系统中的第三类信号分子PQS的产量也明显减少；群体感应系统基因(las， rhl)在过量表达菌中的表达水平明显下降；
3.由于群体感应系统信号分子的量明显减少，而铜绿假单胞菌中的群体感应系统控制着本身许多致病因子的表达。于是我们测定了一些受群体感应系统严格控制的生物学表型。在铜绿假单胞菌中过量表达PA2593基因后，其分解蛋白酶的能力减弱，弹性蛋白酶和鼠李糖酯的量也明显减少；
4.以上这些表型在PA2593基因突变体中却没有明显的变化，其本身在一般培养条件下的表达水平很低。
5.在体外表达和纯化这个蛋白，便于在以后的实验中研究其功能。因此推测，该基因可能编码一种能分解群体感应系统中信号分子C4—HSL和C12-HSL的酶。PA中结构类似的假设蛋白很多，但对该类蛋白的功能研究并不是很清楚。实验对研究结构类似的该类蛋白提供了一个很好的线索和思路。
铜绿假单胞菌;致病菌;调节机理;抗生素治疗;医学微生物学
西北大学
博士
微生物学
段康民
2009
中文
R378.99
102
2009-08-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）