Daxx介导ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡与胆固醇蓄积的关系
目的：研究Daxx介导ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡与胆固醇蓄积的关系。
方法：用不同浓度的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)处理RAW264.7细胞48h，MTT法检测ox-LDL对RAW264.7细胞生长的影响；流式细胞术和DNA断裂片段分析法研究ox-LDL诱导的细胞凋亡；用特异性siRNA沉默Daxx在RAW264.7细胞中的表达，通过AO/EB染色观察基因沉默后的细胞凋亡形态学改变；高效液相色谱(HPLC)检测细胞内胆固醇含量；油红O染色观察细胞内脂滴的形成情况；RealtimeRT-PCR检测细胞内DaxxmRNA、SCAPmRNA的表达情况；用WesternBlot印迹法检测caveolin-1蛋白的表达。
结果：经不同浓度ox-LDL(0mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L)处理RAW264.7细胞48h后，MTF结果显示：随着药物浓度的增加，细胞活性明显下降，依次为100％±7.28％；103.2％±16.35％；76.27％±16.54％；56.49％±11.94％；40.65％±8.76％，ox-LDL在25mg/L时就对细胞活性产生明显的抑制作用，IC50=50.6mg/L。流式细胞术结果显示：对照组细胞凋亡率为2.3％，用12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/Lox-LDL处理RAW264.7细胞48h，凋亡率分别为4.9％、8.6％、14.7％、33.1％，凋亡率呈明显的浓度依赖性变化。此外，50mg/Lox-LDL处理细胞不同时间(0h、12h、24h、48h、72h)，随着ox—LDL作用时间的延长，细胞凋亡率呈时间依赖性增加，50mg/Lox—LDL处理72h组凋亡率为27.9％。同时通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA断片，50mg/Lox—LDL处理细胞48h组可观察到凋亡特征性DNA梯形条带。RealtimeRT—PCR结果发现随着ox—LDL浓度的递增和作用时间的延长，DaxxmRNA的相对表达量呈浓度依赖性和时间依赖性增加。在50mg/Lox—LDL处理细胞48h时DaxxmRNA的相对表达量达到最高(Daxx/β—actinmRNA由1.25×10—4上升至5.3×10—4)。RAW264.7细胞经50mg/Lox—LDL处理48h后，AO/EB染色显示明显的细胞凋亡形态学特征，出现核固缩、碎裂，同时细胞内胆固醇含量显著增加(由76.3μg/mg蛋白上升至368.5μg/mg蛋白)，油红O显示细胞内有大量的脂滴存在。用特异性siRNA沉默Daxx在RAW264.7细胞中的表达能引起凋亡抑制，AO/EB染色显示细胞凋亡率明显降低，同时细胞内胆固醇含量明显下降(由368.5μg/mg蛋白下降至236.9μg/mg蛋白)，油红O染色显示细胞内脂滴也明显减少；Western—blot显示caveolin—1表达呈时间依赖性上调，转染DaxxsiRNA后其表达有所下调；RealtimeRT—PCR结果表明ox—LDL抑制SCAPmRNA的表达，经RNA干扰后，SCAPmRNA的表达上调。
结论：1、Daxx具有介导ox—LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞凋亡作用。
2、Daxx可能通过下调SCAP的表达和上调caveolin—1的表达来影响巨噬细胞源性荷脂细胞胆固醇的摄取，从而发挥促细胞凋亡作用。
Daxx介导;ox-LDL;巨噬细胞凋亡;胆固醇蓄积;蛋白表达
南华大学
硕士
药理学
廖端芳
2007
中文
R972.6;R963
49
2009-07-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）