16S rRNA序列截取程序的设计及16S rRNA技术用于老年腹泻病原菌的筛查
目的：
建立16SrRNA细菌鉴定技术平台，设计DNA序列截取程序，对不明原因老年腹泻患者进行病原菌筛查。
方法：16SrRNA技术包括标本的采集、保存、处理、核酸提取、16SrRNA的PCR扩增、克隆、测序以及结果统计分析等程序。其中，每份标本的PCR产物克隆到T载体，然后在转化的克隆子中要随机挑选100个左右进行测序。当在网上应用BLASTn进行序列比对分析时，必须对原始测序序列进行截取，留下目标16SrRNA序列。以往应用手工截取的工作量大，而且容易出错。本研究以T载体上T7测序引物端和SP6测序引物端紧靠克隆位点的各20bp作为起始和终止截取序列，编制了截取程序DNACutOff。序列比对判定标准：1)取Identities值最高者；2)同一个属的Identities≥97％；3)当Identities值最高者为Unculturedbacteria，而比其Identities值低者中有已知菌属Identities≥97％时，选已知菌属作为比对结果。用16SrRNA细菌鉴定技术检测老年腹泻患者粪便标本，并用特异毒力基因PCR进行验证。
结果：
1)该截取程序DNACutOff截取结果正确，加快了分析速度。
2)应用16SrRNA技术检测了3例老年腹泻患者的粪便标本，结果发现3号标本志贺氏菌属占第二优势菌群，与志贺氏菌属特异基因ipaH检测结果相吻合，提示该患者可能是一例由志贺氏菌引起的痢疾患者；在2号标本中检测到4个志贺氏菌克隆子，同时PCR扩增到志贺氏菌属特异基因ipaH，因此，不能排除志贺氏菌对2号患者的致腹泻作用；1号患者中没有检测到致病菌，而只检测到条件致病菌，因此，1号患者的腹泻可能是由于菌群失调所致。
研究结果说明，本研究成功设计了DNA序列截取程序，该程序不仅适用于16SrRNA序列的截取，也适用于其它序列的截取；同时，建立了16SrRNA细菌检测技术平台，该技术可直接应用于临床标本的检测，对于细菌性新发传染病病原体的快速筛查具有重要的意义。
结论：
1)建立了较完善的16SrRNA细菌检测技术平台2)成功设计了DNA序列截取软件DNACutOff3)用16SrRNA技术检测3例不明原因腹泻患者的病原体：
1号患者的腹泻是由于菌群失调引起；
2号患者不排除志贺氏菌的致病作用；
3号患者是一例痢疾患者。
截取程序设计;老年腹泻;病原菌筛查;细菌鉴定
南华大学
硕士
病原生物学
刘劼
2007
中文
Q522.6;R574.62
43
2009-07-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）