Ghrelin对TNF-α诱导的HepG2细胞PAI-1分泌干预作用及机制的研究
炎症机制在1型糖尿病中发挥着关键的作用。在进展为2型糖尿病的个体中，显示在疾病开始之前的若干年前，这种人就显示着低度炎症状态。处于这种低度炎症状态被认为是导致2型糖尿病病理过程的部分原因。炎症介质，例如肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)等已经被提出与此种因素有关，导致各种形式的糖尿病，胰岛素抵抗。长时间的代谢异常导致了全身的血管并发症，是动脉硬化和心肌梗死等心血管疾病的独立危险因素。
炎症标记物C反应性蛋白(C-reactive protein，CRP)、血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)等在肥胖的胰岛素抵抗个体中浓度明显增高。TNF-α在导致胰岛素抵抗的代谢紊乱中发挥着关键作用。
PAI-1是一单链糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，是组织型纤溶酶原激活物(tissuetype plasminogen activator，tPA)的生理性抑制剂，在维持机体的抗凝—促凝血平衡中起着重要的作用。目前认为血浆中PAI-1增多是动脉粥样硬化等血管、血栓性疾病发生的主要原因之一。胰岛素抵抗与血浆中PAI-1浓度有密切的相关性，PAI-1的增高依赖于胰岛素抵抗状态的存在。在代谢综合征病人所见的加速的动脉粥样硬化过程不仅与异常的代谢有关，也与特异的炎症状态导致的升高的血浆PAI-1有关。PAI-1也可作为联系炎症和胰岛素抵抗的桥梁。
肝脏在糖脂代谢中起重要的作用，是胰岛素抵抗发生的重要部位，也是PAI-1等急性期蛋白产生的主要器官之一。研究表明肝脏是脂肪和肌肉来源的TNF-α的关键靶器官。有证据显示，在代谢综合征表达PAI-1等蛋白上，TNF-α通路有特殊的作用。由此，我们可以通过制作炎症因子TNF-α刺激肝细胞产生PAI-1的模型，模拟胰岛素抵抗个体低度炎症状态下，促炎症因子对肝脏产生PAI-1的作用，以了解炎症因子对肝细胞PAI-1产生的机制，为探讨干预作用制造合理的模型。
核转录因子-κB(nuclear factor-kappaB，NFκB)是一种转录激活子。刺激NFκB激活需要κB抑制蛋白(inhibitorsofκB，IκB)家族成员的顺序磷酸化、泛素化、蛋白酶体依赖的IκBs降解和NFκB核定位信号的暴露，进而与靶基因κB部位结合，调控特定基因转录，参与多种生物学反应。TNF-α等多种信号可诱导核转录因子NFκB的激活，在细胞炎症反应等过程中具有十分重要的作用。糖尿病和代谢综合征等研究的深入证实，NFκB激活的在胰岛素抵抗个体中同样存在，已成为慢性炎症状态的标志物之一。已有文献报道TNF-α在体外可通过激活NFκB通路，刺激细胞PAI-1等蛋白产生。
越来越多的证据证明细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶(c-Junaminoterminuskinase，JNK)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)等MAPK信号通路的激活卷入了TNF-α诱导的PAI-1产生。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/Akt通路的激活抑制PAI-1的产生。
Ghrelin是一种生长激素促分泌素受体(growthhormone secretagogue receptor，GHS-R)的内源性配体，从小鼠和人的胃内分泌细胞中分离出来的一种新的脑肠肽。对Ghrelin作用的研究上，主要集中在促生长激素(growth hormone，GH)分泌方面。同时，其受体分布的广泛性又决定Ghrelin可能具有更广泛的生物学效应。
除对糖脂代谢有影响外，ghrelin还在许多组织如心血管和免疫等组织表达，在局部发挥作用。Ghrelin在血管内皮细胞有抗炎保护功能的作用，发挥抗炎作用部分是通过抑制NFκB通路来实现。但也有报道显示，ghrelin在结肠细胞能通过蛋白激酶C介导NFκB激活刺激IL-8的产生而在发挥促炎因子的作用。可以推断在对炎症的作用方面，ghrelin在不同的组织中发挥作用并不一致，需进一步研究明确。
在肥胖的个体，空腹ghrelin的水平与胰岛素抵抗和PAI-1水平显著负相关。肝脏是血浆PAI-1主要的产生部位之一。Ghrelin受体在肝脏有表达，基于ghrelin对炎症有调节作用，我们设想Ghrelin可能通过抑制NFκB的激活而抑制在胰岛素抵抗状态下炎症因子诱导的肝脏PAI-1等蛋白分泌，对血浆的PAI-1水平有下调作用，从而发挥机体保护作用，减缓胰岛素抵抗个体的血管并发症的进展。故我们设计实验进行体外培养肝细胞系HepG2，给予促炎症因子TNF-α刺激，诱导PAI-1的表达，给予ghrelin干预，检测变化，研究ghrelin在肝脏部位的抗炎功能，为进一步明确ghrelin的功能提供实验依据，也为可能的ghrelin应用于临床糖尿病血管并发症的防治提供线索。同时我们也检测了ghrelin对NFκB，MAPK，PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化的作用，以期对ghrelin干预PAI-1分泌的机制进行初步的探讨。
HepG2细胞是高分化的人类肝癌细胞系，具有人肝细胞绝大多数的生物学功能和生化功能特征，如能产生急性期蛋白，对炎症因子有反应性等。与人肝细胞相比，HePG2细胞更容易获得，并能传代培养，已常规替代肝细胞作为研究肝细胞炎症和代谢的模型。HepG2细胞表达促生长激素分泌激素受体GHS-R，对ghrelin有反应，已用于ghrelin对胰岛素信号转导的研究，故可用此种细胞作为本研究的使用细胞。
方法：
1、HepG2细胞的培养：将HepG2细胞用含10％新生牛血清的DMEM培养液在37℃，5％CO2的条件下在培养箱中饱和湿度培养，每两天换液一次，待细胞处于亚融合状态时，用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液消化传代。用于实验时，80-90％融合的细胞用消化液消化后，加入完全培养基制成单细胞悬液，以1×106个细胞/孔接种于6孔板。
2、细胞无血清培养24h后，用不同浓度(0.1，1，10ng/ml)和时间(2h，6h，24h)TNF-α培养HepG2细胞，ELISA法检测细胞培养上清中PAI-1浓度，RT-PCR法检测PAI-1mRNA表达。
3、Ghrelin单独作用和与TNF-α联合作用细胞，联合作用时行ghrelin预处理1h后给予终浓度为1.0ng/ml的TNF-α培养24h后收取上清和细胞，检测PAI-1的表达，同时检测PAI-1mRNA的变化。
4、用NFκB的特异性抑制剂PDTC预处理HepG2细胞1h，再给予终浓度为1.0ng/ml的TNF-α，继续培养24h，同时设正常对照组，TNF-α组，ghrelin加PDTC预处理组，和PDTC单独作用组。收集细胞和上清，检测PAI-1蛋白和PAI-1mRNA的变化。
5、用浓度100ng/ml的ghrelin预处理细胞1h后加入10ng/ml的TNF-α，培养30min后，收集细胞分别提取胞浆蛋白和核蛋白，Westernblot检测磷酸化的p38MAPK和ERK1/2，JNK，Akt，NFκBp65，IκBα，β-actin蛋白的表达。
6、Westernblot检测PDTC预处理后NFκBp65和IκBα的表达。
7、用浓度100ng/ml的ghrelin预处理细胞1h后加入10ng/ml的TNF-α，培养细胞30min后，免疫细胞化学方法检测NFκBp65蛋白在HepG2细胞的定位。
结论：
1、TNF-α可提高HepG2细胞PAI-1mRNA表达和蛋白分泌。
2、Ghrelin可抑制基础和TNF-α诱导的HepG2细胞PAI-1mRNA表达和蛋白分泌。
3、Ghrelin可能通过抑制NFκB通路激活下调基础和TNF-α诱导的PAI-1的表达。
4、Ghrelin可抑制TNF-α诱导的p38MAPK和JNK通路激活，可能通过此通路参与下调TNF-α诱导的PAI-1表达。
5、Ghrelin对PI3K/Akt通路有明显的激活作用，亦可能通过此通路参与对PAI-1分泌的抑制。
糖尿病;炎症机制;肿瘤坏死因子;HepG2细胞;血浆纤溶酶原激活物抑制剂;胰岛素抵抗
中国医科大学
博士
内科学
刘国良
2008
中文
R587.1
100
2009-04-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）