MicroRNA介导的NBS1基因沉默与端粒酶和相关信号通路关系的研究
目的：
NBS1是MRN复合物(MRE11/RAD50/NBS1复合物)中的重要基因，是DNA双链断裂修复中最重要的一个参与者。近年来一些研究表明MRN复合物对端粒酶阴性肿瘤细胞的生存维系起着重要的作用，NBS1功能受损会使MRN复合物解离，阻止其功能的发挥，破坏端粒酶阴性细胞同源重组介导的端粒长度维持机制(alternative lengthening of telomeres,ALT)，导致其增殖受抑，它的过表达可以诱导转化和肿瘤发生，并与部分肿瘤预后有密切关系。关于NBS1与端粒酶机制的研究很少。最近有人研究显示MRN的减少能导致端粒酶阳性细胞中端粒G-overhangs长度的瞬时缩短。他们在端粒酶阴性细胞中发现Overhangs的长度没有减少，但是在给与外源性端粒酶表达后则发生，因此猜测MRN复合物可能涉及到了端粒酶的复原或激活。对头颈部恶性肿瘤的研究发现NBS1的表达水平与Akt的磷酸化水平相关，通过siRNA导致的内源性Akt表达的抑制可减少过表达NBS1的Ratla细胞的转化活性。还有研究者则认为NBS1是PI3K途径的配体或激活子。对于NBS1与ERK1/2信号通路的关系目前则尚无人研究。
本研究利用RNA干扰领域一种新的研究手段和实验工具—microRNA干扰基因表达的方式，研究MRN复合物的重要成分——NBS1基因沉默与端粒酶阳性肿瘤细胞端粒酶活性之间的关系，并对PI3K/Akt及ERK1/2信号通路与NBS1基因沉默之间的关系进行探讨。
方法：
1、靶向NBS1基因的microRNA序列的设计合成与构建
选择NBS1基因mRNA序列中21nt片段为合适的microRNA靶序列，设计四个针对NBS1基因不同区域的64nt的pre-microRNA寡核苷酸序列，合成并构建入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体并转化至DH5α感受态大肠杆菌。重组体分别命名为NBS1mi-1，NBS1mi-2，NBS1mi-3，NBS1mi-4。
2、重组体的鉴定
对重组体首先在LB平板上进行选择培养。挑取LB平板上的阳性克隆菌落，进行菌落PCR反应，琼脂糖电泳对重组体进行初步鉴定。阳性克隆菌株LB培养基中扩大培养，提取菌液质粒并纯化，送公司测序。
3、细胞培养和转染
选择70％以上汇合的Hela细胞，接种在培养板中。转染时细胞生长密度达到80％以上。实验分组为空载体对照，阴性对照(正常细胞组)，NBS1mi-1，NBS1mi-2，NBS1mi-3，NBS1mi-4。每组设三个平行孔。
4、转染效率检测
收集转染12h后的细胞，进行报告基因GFP的Real-TimePCR实验确定转染效率。
5、检测NBS1基因mRNA表达水平
收集转染12h后的细胞，进行NBS1基因的Real-TimePCR实验确定其mRNA表达水平。
6、Westernblot检测NBS1基因蛋白表达水平
收集转染24h后的细胞，Westernblot检测NBS1mi-1，NBS1mi-2，NBS1mi-3，NBS1mi-4重组体转染组的NBS1基因蛋白表达水平，结合它们NBS1基因mRNA表达结果，选择一个对NBS1基因的表达干扰效果最佳的microRNA真核表达重组载体进行下一步实验。
7、TRAP-PCR-EB法检测细胞端粒酶活性
检测microRNA介导的NBS1基因沉默对Hela细胞端粒酶活性的影响。
8、MTT法绘制细胞生长曲线
检测microRNA介导的NBS1基因沉默对Hela细胞增殖的影响。
9、Westernblot检测Akt，ERK1/2及其磷酸化蛋白表达水平
检测microRNA介导的NBS1基因沉默与PI3K/Akt及ERK1/2信号通路的关系。
10、统计学处理
实验结果以(x)±s表示，采用SPSS13.0统计学软件进行T检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1、设计出了四个靶向NBS1mRAN序列的microRNA序列
经NCBIBlast已排除其非特异同源性，并能与pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体的粘性末端互补配对。
2、重组体鉴定结果
菌落PCR、琼脂糖电泳显示扩增出的片段大小为250bp左右，符合预期结果。初步证明pre-miRNA片段已正确定向插入到载体中。测序分析证明重组体中含有目的片段，且插入片段的碱基序列完整，没有碱基的突变以及丢失。
3、转染效率
Real-TimePCR分析结果显示，转染12h后阴性对照组、空载体对照组、NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4的转染效率分别为(57.26±1.04)％、(55.41±3.68)％、(45.51±2.62)％、(47.55±1.35)％、(50.23±3.27)％、(43.56±2.56)％，经独立样本T检验分析，空载体对照组、NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四个NBS1mi重组体组和阴性对照组相比转染效率的差异不显著(P＞0.05)，它们彼此之间也没有显著差异(P＞0.05)，这提示各组之间GFPmRNA的扩增循环数及起始模板数没有显著的不同，即转染效率没有显著的区别。
4、NBS1基因mRNA表达水平的变化
转染12h后阴性对照组、空载体对照组、NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4重组体组的NBS1基因mRNA表达量分别为0.86±0.16、0.78±0.16、0.24±0.17、0.12±0.12、0.41±0.97、0.48±0.93。NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四个重组体组的NBS1mRNA表达水平和阴性对照组、空载体对照组之间相比较差异有显著性(P＜0.05)。而空载体对照组和阴性对照组的NBS1mRNA表达水平无明显差异(P＞0.05)。NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四个重组体组中NBS1mi-2重组体组的NBS1mRNA表达水平最低。
5、NBS1基因蛋白表达水平的变化
和阴性对照组相比，NBS1基因蛋白表达水平在NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四个重组体中都有所降低，其中NBS1mi-2转染组的NBS1基因蛋白表达水平相对最低。而空载体对照组和阴性对照组相比则无明显变化。结合NBS1mRNA表达的结果，可以确定在四个重组体中，NBS1mi-2重组体对NBS1基因的沉默效果最好。
6、Hela细胞端粒酶活性的改变
根据NBS1基因的mRNA及蛋白表达检测结果，选择干扰效果最好的NBS1mi-2重组体转染细胞检测细胞端粒酶活性变化。和阴性对照组相比，NBS1mi-2的24h、48h、72h转染组的Hela细胞端粒酶活性降低明显(P＜0.05)。且随着NBS1mi-2转染时间的延长，Hela细胞端粒酶活性也逐渐下降，NBS1mi-2转染72h后端粒酶活性的下降程度尤其显著(P＜0.01)。而空载体对照组与阴性对照组相比无明显变化。
7、细胞生长状态的改变
NBS1mi-2转染组和阴性对照组、空载体对照组相比Hela细胞的生长曲线明显趋缓，NBS1mi-2转染后Hela细胞的增殖速度变慢，细胞的增殖受到抑制。
8、磷酸化Akt蛋白表达水平的变化
和阴性对照组相比，NBS1mi-2转染组磷酸化Akt蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)，而空载体对照组和阴性对照组相比则无明显变化(P＞0.05)。Akt蛋白表达水平彼此之间无明显差异。
9、磷酸化ERK1/2蛋白表达水平的变化
和阴性对照组相比，NBS1mi-2转染组磷酸化ERK1/2蛋白表达水平明显降低，差异有显著性(P＜0.01)。而空载体对照组和阴性对照组相比则变化不显著(P＞0.05)。总ERK1/2蛋白表达水平彼此之间无明显差异。
结论：
1、人工设计的靶向目的mRNA的pre-microRNA片段正确完整地插入到了pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体之中，靶向NBS1基因的microRNA真核表达载体的构建成功。
2、各实验组之间的转染效率并不相同，但彼此之间并没有显著性差异，这就消除了因各组转染效率不同可能对其他各检测指标造成的误差。因此，靶向NBS1基因的microRNA真核表达载体转染成功。这为下一步实验奠定了基础。
3、NBS1基因沉默能导致端粒酶阳性细胞Hela细胞中的端粒酶活性的抑制。
4、NBS1基因沉默能导致端粒酶阳性细胞Hela细胞的增殖受抑制。
5、microRNA靶向沉默NBS1基因后导致Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平降低。
6、综合以上结论，我们认为，NBS1基因被其靶向性的microRNA干扰其表达后，通过对PI3K/Akt信号通路和ERK1/2信号通路的共同抑制导致细胞端粒酶活性降低，端粒酶阳性细胞Hela细胞的增殖受抑制。NBS1基因有可能成为端粒酶阳性肿瘤基因治疗的新靶点。
肿瘤病理学;MicroRNA介导;NBS1基因;端粒酶;信号通路
中国医科大学
博士
肿瘤学
任常山
2008
中文
R730.2
83
2009-04-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）