碘缺乏和甲状腺功能减退损伤海马空间和条件学习记忆及其CaMKⅡ和MAPK信号转导途径的机制研究
目的：
碘是人体必不可少的微量元素之一，是甲状腺激素合成的重要原料，并影响甲状腺激素的合成与分泌。甲状腺激素是正常生长发育所必需的激素，具有促进组织分化、生长与发育成熟的作用，对脑的发育尤为重要。海马是学习和记忆的关键脑区，对甲状腺激素敏感。在发育的关键期，短暂的甲状腺激素缺乏，会导致海马区域神经系统功能上的破坏和不可逆性的损伤，对海马神经发育以及突触可塑性产生极大的影响，严重的甲状腺激素缺乏可导致被动躲避、空间学习和操作式条件反射受损。钙离子-钙调蛋白-钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径(以下简称为CaMKⅡ信号转导途径)和腺苷酸环化酶/cAMP-依赖性蛋白激酶途径(以下简称为MAPK信号转导途径)是在学习与记忆形成过程中重要的第二信使信号转导系统。在脑发育过程中碘缺乏和甲状腺功能减退如何影响学习记忆形成及CaMKⅡ和MAPK信号转导途径尚不清楚，其对海马CA1、CA3和DG区的影响作用如何也有待研究。我们采用碘缺乏饲料和不同剂量的PTU饮水建立碘缺乏和甲状腺功能减退模型，研究仔鼠神经行为学表现，及学习记忆前后海马CA1、CA3和DG区CaMKⅡ和MAPK信号转导途径的改变，以在信号转导和蛋白分子水平上阐明碘缺乏和甲状腺功能减退损害神经系统发育和学习记忆功能的机制。
实验方法：
1、实验动物与分组
健康2月龄雌性Wistar大鼠，交配妊娠后，取孕鼠28只，按体重随机分成对照组、5ppm组、15ppm组和碘缺乏组，每组7只孕鼠。自GD6起，碘缺乏组饲以缺碘地区粮食配制的饲料，饮用自来水；5ppm组和15ppm组孕鼠分别给予5ppm和15ppmPTU饮水，普通饲料，至仔鼠PN28时恢复正常饲料和饮水。在整个试验过程中，测定母鼠及仔鼠体重，观察仔鼠开眼情况。
2、血清TSH、TH测定
分别于PN14、PN21、PN28和PN42时，取仔鼠心脏采血，3000rpm离心5min，分离血清。采用固相化学免疫发光法测定血清中TSH、FT3和FT4含量。
3、仔鼠海马重量测定
分别于PN14、PN21、PN28和PN42时每组取3只仔鼠，乙醚麻醉后断头，取脑，剥离双侧海马，称重。
4、海马CA1、CA3和DG区免疫组织化学蛋白表达分析
分别于PN7、PN14、PN21和PN28时每组取5只仔鼠，4％多聚甲醛灌流固定大脑，石蜡包埋，切片。免疫组织化学染色，观察海马CA1、CA3和DG区总CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaN、Ng、BDNF、总ERK1/2、p-ERK1/2、总CREB、p-CREB的免疫表达。用图象分析系统及图象分析软件分析海马CA1、CA3和DG区各蛋白表达的总积分光密度。
5、海马CA1、CA3和DG区westernblot蛋白测定分析
分别于PN14、PN21和PN28时，每组选取3只仔鼠，断头取脑，剥离海马，分离CA1、CA3和DG区，采用westernblot方法分别测定海马CA1、CA3和DG区CaM、总CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaN、Ng、BDNF、总ERK1/2、p-ERK1/2、总CREB、p-CREB的蛋白。全自动凝胶成像分析系统照相，测得各条带的净光密度值。
6、水迷宫实验
在PN30时，将仔鼠置于水迷宫，了解安全台阶的存在后，将其放于起点，自由游泳，记录其进入盲端的错误次数以及爬上安全台阶的时间(即潜伏期)。训练3天后，自第4天起，将仔鼠置于迷宫最远端作为游泳起点，记录2分钟内仔鼠进入盲端的错误次数和潜伏期，进行分析。
7、穿梭箱实验
在PN37时，将仔鼠放入穿梭箱中，给予10s峰鸣刺激，仔鼠若完成穿梭，则该次循环结束，称为主动逃避；若未完成，则给予10s电击刺激，使其完成穿梭，相应的电击结束，称为被动逃避。如此反复循环10次。共记录6天的结果，进行数据分析。
8、学习记忆过程影响CaMKⅡ和MAPK信号转导途径的测定
在穿梭箱实验完成后(即PN42时)，立刻每组随机取5只仔鼠，灌流固定，石蜡包埋、切片后，免疫组织化学染色，观察海马CA1、CA3和DG区Ca2+和MAPK信号转导途径各蛋白的免疫表达。每组随机取3只仔鼠，断头取脑，剥离海马，分离CA1、CA3和DG区后，采用westernblot方法分别测定海马CA1、CA3和DG区CaMKⅡ和MAPK信号转导途径各蛋白的水平。
9、统计分析
结果表示为mean±S.E.M.。全部数据采用SPSS11.5统计软件进行统计分析。采用单因素方差分析(ANOVA)比较各组间的统计学差异，当差异有统计学意义时，用SNK进行组间比较。采用独立样本t检验比较PN28和PN42间数据的统计学差异。P<0.05为差异有统计学意义。
实验结果：
1、母鼠和仔鼠体重及仔鼠海马重、开眼率结果碘缺乏与甲状腺功能减退可影响
母鼠和仔鼠体重，孕期和哺乳期碘缺乏组母鼠体重明显低于对照组(P<0.05)；5ppm组、15ppm组和碘缺乏组仔鼠体重增长缓慢，海马重量减轻，均显著低于正常水平(P<0.05)。15ppm组和碘缺乏组仔鼠开眼延迟，同期开眼率明显低于对照组(P<0.05)。
2、TSH和TH水平甲状腺功能减退
可通过反馈作用促进TSH分泌增多，FT3和FT4水平下降。在PN14、PN21和PN28时，与对照组相比，5ppm组和15ppm组TSH水平显著升高(P<0.05)，碘缺乏组无明显变化；15ppm组和碘缺乏组的FT3和FT4水平明显下降(P<0.05)。停用PTU和碘缺乏饲料后(PN42)，TSH和TH水平均恢复正常。
3、海马CA1、CA3和DG区免疫组织化学蛋白表达结果
PN14、PN21和PN28时，在CA1和CA3区，15ppm组和碘缺乏组仔鼠海马CaMKⅡ、Ng、BDNF、ERK1/2和CREB表达显著低于对照组，CaN的表达显著高于对照组，有统计学意义(P<0.05)；在DG区，15ppm组和碘缺乏组仔鼠海马CaMKⅡ、CaN、BDNF和CREB表达显著低于对照组(P<0.05)，而Ng和ERK1/2与对照组相比无显著差异。PN7时，各区均几乎观察不到阳性反应产物，各组间蛋白表达无显著差异。
4、海马CA1、CA3和DG区westernblot蛋白测定结果
在CA1和CA3区，15ppm组和碘缺乏组仔鼠海马CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaM、Ng、BDNF、ERK1/2、P-ERK1/2、CREB和P-CREB蛋白水平显著低于对照组，CaN则高于对照组，有统计学意义(P<0.05)；在DG区，15ppm组和碘缺乏组仔鼠海马CaMKⅡ、CaN、BDNF、CREB和p-CREB蛋白水平显著低于对照组(P<0.05)，而p-CaMKⅡ、CaM、Ng、ERK1/2和P-ERK1/2与对照组相比无显著差异。
5、神经行为学结果
在水迷宫实验测试期，15ppm组和碘缺乏组仔鼠的潜伏期和进入各盲端的错误次数明显多于对照组和5ppm组；在穿梭箱实验第3-6天，15ppm组和碘缺乏组遭电击次数、主动和被动回避时间明显多于对照组与5ppm组，均具统计学意义(P<0.05)。
6、学习记忆过程对CaMKⅡ和MAPK信号转导途径的影响
在神经行为学实验后，对照组除CaN明显下降外，其余各蛋白的表达水平均显著上升(P<0.05)；15ppm组和碘缺乏组在CA1和CA3区各蛋白的表达水平无明显变化，但仍明显低于对照组，而CaN显著高于对照组，具统计学意义(P<0.05)；在DG区，15ppm组和碘缺乏组CaN明显降低，p-CaMKⅡ、CaM、Ng、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB和p-CREB的蛋白表达均显著高于神经行为学实验前。
结论：
1、碘缺乏和甲状腺功能减退可影响大鼠仔鼠发育，使其体重下降，海马重量减轻，开眼延迟。
2、碘缺乏和甲状腺功能减退可增加海马CA1和CA3区CaN活性，下调CaMKⅡ信号转导途径的蛋白水平；在DG区，碘缺乏和甲状腺功能减退不影响p-CaMKⅡ、CaM和Ng的蛋白表达。
3、碘缺乏和甲状腺功能减退可下调海马CA1和CA3区MAPK信号转导途径的蛋白水平；在DG区，碘缺乏和甲状腺功能减退不影响ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达。
4、碘缺乏和甲状腺功能减退可损伤仔鼠空间和条件学习记忆，使其找到安全区域的潜伏期及主动和被动躲避时间延长，进入迷宫盲端的错误次数和遭电击次数增加。与神经行为学实验前相比，海马CA1和CA3区CaMKⅡ和MAPK信号转导途径的蛋白水平无明显变化，DG区p-CaMKⅡ、CaM、Ng、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB和p-CREB的蛋白表达均显著升高，CaN表达下降。
5、碘缺乏和甲状腺功能减退损伤仔鼠空间和条件学习记忆形成的机制可能是由于其增加海马CA1和CA3区CaN活性，下调CaMKⅡ和MAPK信号转导途径的蛋白水平，从而损伤神经细胞突触可塑性，影响正常脑发育和神经回路的形成，导致学习记忆功能下降。
碘缺乏;甲状腺功能减退;学习记忆;CaMKⅡ;MAPK;信号转导途径
中国医科大学
博士
劳动卫生与环境卫生学
陈杰
2008
中文
R581
156
2009-04-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）