CLOCK/BMAL1调控脱腺苷酶Nocturnin转录的机制研究及钟控microRNA的鉴定
Noctumin是具有生物节律转录特点的基因之一，在RNA水平具有明确的日节律变化，夜间呈现高表达状态，故得名Nocturnin(黑夜因子)。Nocturnin蛋白质所具有的结构域从酵母到人都具有高度的保守性。Noctumin功能研究发现它具有脱腺苷酶(deadenylase)的作用，参与mRNA的降解以终止翻译过程。
Nocturnin基因敲除小鼠的脂肪积累能力和野生型对照相比明显下降，当饲喂高脂饮食时，基因敲除小鼠对肥胖和脂肪变性的抵抗能力明显强于野生型对照小鼠，并且基因敲除小鼠的脂肪、肌肉和肝脏的胰岛素敏感性明显增强，而胰腺的葡萄糖反应性下降。可见在正常情况下，Nocturnin的作用在于调节代谢的昼夜节律性变化。肥胖和高血脂在世界范围内都是公认的影响人类健康的疾病并且受到广泛的关注。Noctumin表达调控的研究对于正确认识和防治肥胖和高血脂、以及与Noctumin有关的一些未知生理功能有重要意义。尽管Nocturnin作为钟控基因是分子生物钟调控细胞代谢功能的一个重要因子，但分子钟调控Nocturnin的机制尚不十分清楚。
在爪蟾的Nocturnin转录调控研究中发现，该基因的日节律表达是通过Nocturnin元件(Nocturninelement，NE)(GTGACGTG)由磷酸化的CREB调控的结果。然而，Oishi等人的小鼠CLOCK敲除模型的芯片检测结果显示，Noctumin与periodl等钟基因一样，节律表达受到了影响。这说明高等动物的Nocturnin的节律表达可能不同于爪蟾，而可能是由CLOCK/BMAL1异二聚体通过结合于E-box而激活转录。但他们并没有证实这种可能性。我们的此项研究工作的主要目的是阐明Nocturnin的转录激活是否是由CLOCK/BMAL1异二聚体通过结合于E-box所致。
本工作分析了Noctumin启动子区的序列。结果显示，Noctumin的转录调控可能由E-box参与，即CLOCK/BMAL1直接通过E-box元件调控Nocturnin的转录。然后，我们进一步采用染色体免疫共沉淀技术发现Nocturnin的转录可能直接受到了CLOCK/BMAL1的调控。
本部分研究利用Huh7细胞节律模型进行了Noctumin转录水平的检测。在72小时的连续检测中，发现人Nocturnin和钟基因Periodl的转录水平呈现十分相近的变化趋势，即在CT16-20，CT40和CT68(CT，circadiantime)三个时间点达到峰值，在CT24-32两个时间点达到谷值。这说明人Nocturnin的转录受到了内源性钟基因的调控，并且调控方式和人Periodl可能相同。这一现象与Noctumin生物信息学预测结果一致。
为了进一步对Noctumin启动子区E-box的功能进行检测，我们首先利用荧光素酶报告基因检测技术验证了CLOCK/BMAL1具有对人Periodl和Nocturnin的E-box的转录激活能力，然后对两类E-box(E-box1和E-box2)进行突变操作，再检测E-box对Noctunin启动子区的转录激活能力，发现Nocturnin启动子区的E-box2的转录激活能力要比E-box1更为明显。最后通过DNA亲和层析，验证了不同E-box与CLOCK/BMAL1的结合能力，结果显示E-box2的亲和能力要比E-box1更为明显，这些结果说明E-box是CLOCK/BMAL1调控Nocturnin转录的重要顺式作用元件；人Nocturnin的转录与爪蟾Nocturnin的转录机制不同的是CLOCK/BMAL1可以通过E-box元件调控其转录；Nocturnin启动子区的E-box2的作用要比E-box1更为明显。
此外，依据节律基因调控机制中钟控基因很大程度上依赖于转录因子CLOCK直接通过E-box元件激活转录。而Pri-microRNA的转录调控和基因的调控机制是相同的，所以我们认为应该存在具有钟控基因一样的转录调控机制的钟控microRNA。我们根据JohnKim等人在人、小鼠和大鼠脑组织中特异表达microRNA的鉴定结果选择了86个microRNA，进行转录调控区域E-box元件分析，然后根据E-box元件在人、小鼠和大鼠中的同源性挑选出候选的钟控microRNA。再进一步进行染色体免疫共沉淀验证，并在小鼠转录模型中验证这些microRNA的表达变化。从而我们发现了三个受到CLOCK调控的钟控microRNA(miR140、miR329和miR337)进一步研究参与到分子生物钟的microRNA的调控机制和功能提供了基础。
本研究中，我们筛选到钟控基因Nocturnin，并证明了Nocturnin接受CLOCK/BMAL1的转录调控；并且依据CLOCK调控的分子钟的转录机制鉴定了三个钟控microRNA(miR140、miR329和miR337)。
生物节律转录;Nocturnin;E-box;生物钟;钟控基因;脱腺苷酶
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
生理学
曹济民;彭小忠
2008
中文
Q811.213
113
2009-04-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）