GTPase蛋白RSA-14-44的功能研究
精子发生是一个错综复杂且高度有序的动态过程，其间生精干细胞经过有丝分裂、减数分裂、核浓缩、细胞变形、激活等众多复杂的变化，最终发育、分化成为成熟的精子。这些不同的细胞事件既相对独立、相互区别，同时又相互关联、相互衔接，整合成为一个系统、高效并且可控的有机整体。为确保种群的繁衍和物种的进化，生命体逐渐发展出一整套精密、复杂的机制来调节整个精子发生过程。其中一个很重要的方面就是依据不同发育阶段的需要，在时间和空间上对精子发生相关基因的表达进行严密的控制。因此，分离、克隆不同发育阶段的差异表达基因，深入研究它们在精子发生过程中所发挥的作用，对于揭示精子发生机理和促进人类生殖健康均具有重要意义。
在本实验室的前期工作中，我们利用激光捕获显微切割技术(LaserCaptureMicrodissection，LCM)，成功地捕获了大鼠的初级精母细胞和圆形精子细胞；通过抑制性消减杂交技术(SuppressiveSubstractiveHybridization，SSH)构建圆形精子细胞消减初级精母细胞的消减cDNA文库(RSA)，并从中筛选出差异表达基因。本研究中所涉及的RSA-14-44/mRSA-14-44就是通过上述筛选所得到的一个新基因，其所对应的原始克隆编号为14-44，因此命名为RSA-14-44。该基因的GenBank登录号为AY149343；编码序列长度为582bp，编码一个由193个氨基酸组成并具有Rho-GTPase保守结构域的蛋白质。
生物信息学分析结果显示，RSA-14-44的氨基酸序列与RhoGTPase家族中的RhoAlike亚家族成员高度同源。同时，我们通过体外实验证实纯化的GST-RSA-14-44蛋白具有GTPase活性。因此，确定RSA-14-44是RhoAlike亚家族的一个新成员。
针对RSA-14-44的多组织表达分析结果表明，该基因在大鼠睾丸组织中特异表达。对大鼠睾丸组织的免疫组织化学研究证实，RSA-14-44的表达与精子发生过程密切相关；主要存在于除精原细胞外的各期生精细胞中，特别是处于第一次减数分裂末期的初级精母细胞中。
利用生物信息学数据库进行同源序列比对，在小鼠中找到一个RSA-14-44的同源序列基因4930544GllRik(GeneID:67653)。二者所编码的蛋白质序列高度同源，相似度达95.3％，并且具有相同的睾丸组织表达特异性。因此，我们确认该基因是RSA-14-44的小鼠同源基因，并将其命名为mRSA-14-44。
在前期工作中，我们利用酵母双杂交技术筛选睾丸组织中可能存在的与RSA-14-44相互作用的蛋白质，结果显示蛋白酶体的组成蛋白PSMB5与RSA-14-44之间存在相互作用。利用GST-pulldown的方法，我们证实RSA-14-44与PSMB5之间存在相互作用。同时，我们还构建了mRSA-14-44的真核表达质粒，并通过免疫共沉淀实验验证了mRSA-14-44与PSMB5之间存在相互作用。
为明确RSA-14-44/mRSA-14-44在精子发生过程中的生物学功能，我们首先通过免疫荧光观察RSA-14-44和PSMB5在大鼠精子发生过程中的表达变化。结果显示，二者在分离到的各期生精细胞中共定位，包括次级精母细胞、圆形精子细胞、长形精子细胞和成熟的精子；二者的定位与整个精子发生过程密切相关，随着发育阶段的不同产生相应的变化。其次，蛋白酶体活性实验的结果证实在过表达RSA-14-441mRSA-14-44或共表达RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5的情况下，细胞的蛋白酶体活性并未发生显著变化。此外，我们还利用高通量筛选平台对RSA-14-44/mRSA-14-44可能参与的细胞信号传递通路进行鉴定。分析结果显示，除CREB通路外，过表达RSA-14-44/mRSA-14-44对所选定的细胞信号通路并未产生显著的影响。
为进一步明确RSA-14-44/mRSA-14-44与PSMB5相互作用同RSA-14-44/mRSA-14-44蛋白质结构之间的关系，我们构建了分别针对RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5的突变体蛋白表达质粒，并通过免疫共沉淀和甘油密度梯度分离细胞组分来进行相应研究。免疫共沉淀实验结果显示RSA-14-44/mRSA-14-44与PSMB5之间存在的相互作用并不依赖于RSA-14-44/mRSA-14-44的激活；同时也不依赖于RSA-14-44/mRSA-14-44中的效应蛋白结合区、高可变区结构；但位于CAAXmotif的190位Cysteine对维持二者间的相互作用至关重要。结构预测显示RSA-14-44/mRSA-14-44中的C190位点可能存在棕榈酰化(palmitoylation)修饰。
另一方面，利用甘油密度梯度离心分离不同的细胞组分，分析其中RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5的分布。实验结果表明细胞中的PSMB5以前体形式合成，其N-terminal包含propeptide结构，需要经过自剪切加工移除propeptide，转变为成熟形式的PSMB5；二者存在于不同的细胞组分之中，成熟体形式PSMB5与蛋白酶体的另一个非催化亚单位PSMA7共存于沉降系数较大的细胞组分，前体形式的：PSMB5主要与RSA-14-44/mRSA-14-44共存于沉降系数较小的细胞组分。
在上述研究的基础上，我们还进一步探讨了RSA-14-44/mRSA-14-44对细胞中PSMB5加工过程的影响。分析结果显示，在细胞中共表达RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5能够相应提高其中前体形式和成熟体形式PSMB5的蛋白质水平，但并不影响前体蛋白的自剪切加工速率。
生精干细胞;细胞事件;除精原细胞;蛋白质水平
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
生物化学与分子生物学
王琳芳;缪时英
2008
中文
R321.1
120
2009-04-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）