大鼠UCHL1基因RNAi重组慢病毒构建、鉴定及功能的实验研究
目的：
设计、构建、筛选针对大鼠UCHL1基因的RNA干涉(RNAi)重组慢病毒表达系统，观察RNAi重组慢病毒对UCHL1表达水平以及对神经元存活、生长以及凋亡的影响，为下一步探讨UCHL1表达改变对神经元损伤和修复的意义提供前期研究基础。
方法：
1.选用质粒pWPXL-MOD构建UCHL1基因重组表达载体，取得阳性克隆并命名为pWPXL-MOD-UCHL1并通过鉴定。
2.应用siRNA设计工具针对大鼠UCHL1基因设计三条特异性siRNA靶序列，同时设计一条Negative序列用于对照组实验，合成的寡核苷酸。
3.选用粘末端线性质粒pRNAT-U6.2构建UCHL1siRNA表达载体。将3个双粘UCHL1靶向发卡DNA片段(shRNA)和1个无关对照序列发卡DNA片段(NEGTIVE)，分别与pRNAT-U6.2连接，将重组载体转化感受态细胞，用pRNAT-U6.2的插入鉴定引物进行PCR鉴定，得到阳性重组子，分别命名为pRNAT-U6.2-shRNA1，pRNAT-U6.2-shRNA2，pRNAT-U6.2-shRNA3和pRNAT-U6.2-NEG；对插入序列进行DNA序列测定，提取质粒备用。
4.常规方法培养293FT细胞，pWPXL-MOD-UCHL1，pRNAT-U6.2-shRNA1，pRNAT-U6.2-shRNA2，pRNAT-U6.2-shRNA3和pRNAT-U6.2-NEG质粒分别与慢病毒包装质粒混合物(TELEVECTORTM)共转染293FT细胞；生产和纯化病毒，分别命名为Lv-UCHLI，Lv-shRNA1，Lv-shRNA2，Lv-shRNA3，Lv-shNEG，使用杀稻瘟素测定病毒的滴度。
5.使用重组慢病毒Lv-UCHL1，Lv-shRNA1，Lv-shRNA2，Lv-shRNA3，Lv-shNEG及空病毒感染293FT细胞，使用倒置荧光显微镜观察荧光，确定慢病毒感染目的细胞的效率；以GADPH为内参照，通过Western-blot分析293FT细胞UCHL1蛋白表达水平的改变，选择出抑制效率最高的RNAi慢病毒以供后续实验。
6.体外分离、培养大鼠脑皮层神经元，通过形态学、NSE和Hochest33258荧光染色等方法鉴定神经元，建立稳定的实验研究模型。
7.用RNAi重组慢病毒、空病毒分别转染体外培养的神经元，使用倒置荧光显微镜观察荧光，确定慢病毒感染目的细胞的效率，通过RT-PCR、Western-blot检测UCHL1在mRNA和蛋白水平的表达，确认干涉效果。
8.观察转染后神经元形态，采用MTT比色法检测细胞存活和生长等生物学行为的改变，采用流式细胞技术和AnnexinV染色检测细胞的凋亡。
结果：
1.成功地构建了UCHL1基因重组质粒，取得了阳性克隆并通过了鉴定。
2.成功地设计和构建了针对UCHL1基因的siRNA慢病毒载体。
3.在293FT细胞中成功地包装和生产了UCHL1和RNAi重组慢病毒并进行了滴度测定。
4.使用RNAi重组慢病毒转染293FT细胞成功地筛选出对UCHL1抑制率最高的病毒。
5.成功地分离、培养了大鼠脑皮层神经元，建立稳定的实验研究模型。
6.使用RNAi重组慢病毒稳定转染体外培养的皮层神经元，UCHL1的mRNA和蛋白表达水平均明显下调。
7.RNAi重组慢病毒抑制UCHL1表达后，体外培养的皮层神经元的生长受到抑制，细胞凋亡比例显著提高。
结论：
慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。通过建立稳定的鼠皮层神经元体外培养模型，为进一步利用RNAi技术进行基因表达调控的研究奠定了基础。UCHL1高度特异性地分布于神经元，是一种在泛素化蛋白降解途径中起到关键的作用的酶。通过RNAi重组慢病毒转染体外培养的神经元可以稳定、高效、特异性地抑制UCHL1的表达，并对神经元的存活、生长和凋亡产生很大影响。
UCHL1基因;RNA干涉;神经元损伤;慢病毒;体外培养
天津医科大学
博士
外科学 神外
杨树源
2008
中文
R741.02
110
2009-04-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）