骨桥蛋白在大鼠脑创伤中的作用研究
本文主要从以下几部分进行了论述：
第一部分骨桥蛋白(OPN)添加对大鼠脑创伤影响的实验研究
目的：研究OPN添加对大鼠脑创伤的作用。
方法：1.建立培养大鼠脑皮质神经细胞离心损伤模型。模型建立后立即分别添加生理盐水或不同浓度(0.01μg/ml、0.05μg/ml和0.1μg/ml)OPN。分别于伤后24h、48h、72h、120h和168h收集培养神经细胞，用MTT法检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
2.制作大鼠侧方液压冲击(LFP)脑创伤模型，研制大鼠呼吸面罩。大鼠中度LFP脑创伤后24h内分别行立体定向脑室内注射生理盐水5μl或OPN5μl(50ng)。于伤后72h、120h和168h分别进行大鼠神经学评分、行走和平衡运动功能检测，Morris水迷宫记忆功能评价。随后大鼠行心脏灌注取脑，原位细胞凋亡检测。
结果：1.添加OPN后神经细胞增殖活跃，凋亡率降低，呈剂量依赖关系。
2.应用面罩呼吸机辅助呼吸，LFP脑创伤大鼠的死亡率由30％降低到11.84％。
3.脑室内注射OPN后LFP脑创伤大鼠水迷宫记忆力、神经学评分、行走和平衡功能改善。
结论：OPN可促进培养的神经胶质细胞增殖，抑制神经细胞凋亡。脑室内注射OPN可促进脑创伤后大鼠的记忆力和神经功能恢复，呈剂量依赖关系。
第二部分OPN表达封闭对大鼠脑创伤影响的实验研究
目的：研究OPN基因沉默对大鼠脑创伤的影响。
方法：1.用载体TG005构建OPN表达载体：根据OPN基因信息设计并合成引物。提取胎鼠心肌总RNA，反转录合成cDNA，PCR合成目的片段。目的片段经Mlul和Spel双酶切、纯化。载体双酶切，去磷酸化。酶切目的片段和酶切载体连接，转化感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取重组质粒，双酶切后测序鉴定命名为TG005-OPN。TG005-OPN与脂质体Lipofectamine2000共转染293T细胞，RT-PCR检测，电泳鉴定。
2.构建OPN特异性RNAi慢病毒载体：根据OPN基因信息设计3条shRNA序列：OPN-Sh1：ACGATGATGACGACGACGA，OPN-Sh2：ATGACGACGACGATGACGA，OPN-Sh3：AGCACACAAGCAGACGTTT。合成三对互补的DNA片段，PCR扩增后用BamHI和XhoI双酶切，纯化，载体pRNAi-U6.2/Lenti双酶切，去磷酸化。酶切DNA片段与酶切载体连接，转化感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆，测序鉴定并命名为Lv-OPN-Sh。
3.慢病毒载体包装，鉴定：用Lipofectamine2000将慢病毒载体4质粒(pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G及Lv-OPN-Sh)转移至293T包装细胞，产生重组慢病毒颗粒。重组慢病毒颗粒与TG005-OPN共转染293T细胞，组织蛋白抽提及Western检测OPN基因沉默效果。
4.慢病毒重组颗粒转染大鼠创伤神经细胞，检测神经细胞凋亡。
5.慢病毒重组颗粒5μl/空载体5μl/生理盐水5μl/TG005-OPN5μl分别行LFP脑创伤大鼠脑室内注射。于伤后72h、120h和168h分别进行大鼠神经行为学评价及记忆功能评价。
结果：1.TG005与目的插入片段连接阳性菌落酶切电泳显示插入片段约1000bp，该片段测序并与GenBank中OPN序列比较证明该片段为OPN，OPN表达载体TG005-OPN制备成功。
2.pRNAi-U6.2/Lenti载体与设计合成的3条OPN-shRNA连接，阳性菌落测序鉴定证明3个质粒构建成功并分别命名为Lv-OPN-Sh(1，2，3)。
3.脂质体及慢病毒四质粒共转染包装细胞293T，荧光显微镜下见大量绿色荧光，证实有大量质粒转染入293T细胞。
4.TG005-OPN与慢病毒共转染293T后Western检测显示Lv-OPN-Sh2可明显抑制OPN表达。
5.Lv-OPN-Sh2慢病毒重组颗粒转染损伤神经细胞，神经细胞凋亡率增加，但无统计学意义。
6.Lv-OPN-Sh2慢病毒重组颗粒脑室内注射后，大鼠的神经行为功能和记忆功能无明显改变。
结论：慢病毒载体介导的OPN特异性RNAi基因沉默对大鼠创伤神经细胞的凋亡影响不明显，对LFP脑创伤大鼠的运动功能和记忆功能影响也不明显。
骨桥蛋白;脑创伤;RNA干涉;慢病毒载体
天津医科大学
博士
外科学 神外
杨树源;张建宁
2008
中文
R651.15
117
2009-04-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）