HIV-1 gp120对视网膜色素上皮细胞功能影响及其分子机制的研究
I型人类免疫缺陷病毒引起的获得性免疫缺陷综合征，即艾滋病，是一种致命性的传染病，艾滋病具有多项合并症，大约50-75％的艾滋病感染者合并有眼部并发症，尸检证实眼底微血管病变发病率可高达89％。AIDS视网膜病，又称HIV视网膜病/非感染性HIV视网膜病，疾病发生早、累及人群广泛。病理特点表现为视网膜微血管渗漏、神经节细胞丧失，神经纤维层变薄，临床检测视功能的损害往往先于患者自觉症状出现之前。目前治疗以全身抗艾治疗结合局部手术治疗为主，临床疗效不理想，尽管学者们公认AIDS视网膜病的发病基础是HTV造成的血-视网膜屏障崩溃，但其具体发病机理并不明确，对AIDS视网膜病发病机制的探索将有利于临床诊治工作的有效开展。
HIV-1包膜蛋白gp120在病毒对宿主细胞的侵犯机制中的作用已有大量文献报道。首先，病毒表面的结合态gp120在介导HIV对宿主细胞的结合中具有关键作用，其次，自感染细胞释放的游离态gp120的细胞毒性同样不容忽视。如gp120诱导细胞氧化应激，促进炎症介质释放、细胞凋亡，细胞间紧密连接破坏等等。在视网膜疾病的研究中，视网膜色素上皮细胞具有重要地位。RPE及其细胞间紧密连接不但形成基底膜-Brush膜-脉络膜复合体，参与构成血-视网膜屏障，细胞内还含有多种抗氧化剂，包括水溶性代谢物和酶如酸性维生素C，脂溶性物质如维生素E、黑色素等，是抗氧化作用的重要场所。此外，RPE细胞能特异性地吞噬感光细胞的外节段，这对于视细胞外节更新和正常视觉功能的维持具有重要意义。遗憾的是，国际上目前有关AIDS视网膜并发症的研究中，gp120是否导致RPE细胞病理改变及其发病机制的报道相当缺乏。
本研究首次从分子水平探讨gp120对RPE细胞的功能影响及其作用环节，预期研究结果可能为HIV眼部感染的防治提供理论和实验依据。本课题从以下四个方面入手：
一、gp120体外对RPE细胞增殖和凋亡的影响
1.目的：探讨体外实验中gp120对RPE细胞的生长增殖及凋亡的影响，以及细胞株D407有关CD4，CXCR4，CCR5受体表达的免疫化学特征。
2.研究方法：
2.1RPE细胞的免疫化学特征
培养RPE原代细胞与细胞株D407，用免疫组织化学的方法鉴定原代细胞角蛋白染色，以及细胞株D407有关CD4，CXCR4，CCR5的表达；
2.2gp120对RPE细胞增殖和凋亡的影响
使用4-6代的原代细胞和D407细胞株，首先检测在96孔板不同密度种植的细胞第24小时的生长曲线，并选择3000细胞/孔为生长抑制实验的种植密度。用MTT法检测不同浓度的gp120分别作用RPE细胞24小时，48小时以及72小时的生长率。使用流式细胞术检测经0.1μg/ml的gp120处理RPE细胞24、48和72小时后的凋亡率。
2.3透射电镜观察gp120对D-407细胞超微结构的影响
采用透射电镜的方法，观察经0.1μg/ml的gp120处理后的D407细胞超微结构的影响。
3.研究结果：
3.1D407细胞株免疫细胞染色CD4受体为阴性，CXCR4及CCR5受体为阳性，在细胞浆内和细胞膜上均有分布。HIV-Igp120对视网膜色素上皮细胞功能影响及其分子机制的研究.
3.2MTT细胞抑制实验和流式细胞仪凋亡率检测结果：第48，72小时处理组自gp120浓度0.004μg/ml起，对RPE细胞株D-407及原代细胞的生长率有轻微的抑制作用；第48小时最大抑制率为20％。经0.1μg/ml的gp120处理不同时间的RPE细胞，没有发现细胞凋亡率有显著性差异变化。
3.3透射电镜发现经gp120处理后的D407细胞出现了线粒体肿胀、溶酶体增多以及早期凋亡的表现。
4.结论：
RPE细胞可表达辅助受体CXCR4和CCR5。高浓度的gp120自第48小时开始对RPE细胞的生长具有抑制作用，而没有显著诱导细胞凋亡的效应，但电镜下超微结构具有细胞器损害的表现。
二、gp120对D407细胞影响的蛋白质组学研究
1.目的：
比较gp120处理前后D407细胞内蛋白质表达谱的变化，从整体的蛋白质水平对gp120影响D407细胞的分子机理进行初步探索并提供线索。
2.研究方法：
0.1μg/ml的gp120处理体外培养的D407细胞，利用双向凝胶电泳分离处理前后细胞的总蛋白质，建立双向凝胶电泳图谱，图像分析选取部分差异表达的蛋白质，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析获取肽质量指纹图谱，搜索NCBI数据库鉴定蛋白质。
3.研究结果：
得到分辨率和重复性较好的gp120处理前后D407细胞双向凝胶电泳图谱，筛选出差异表达蛋白质点11个进行质谱分析，获得肽质量指纹图谱，主要为：1、核糖核蛋白体家族；2、氧化应激相关酶，如SOD-Mn；3、其他，如核纤层蛋白，钙调节蛋白等。
4.结论：
Gp120对D407的影响可能涉及细胞氧化应激、细胞内信号转导及细胞骨架构建等方面。
三、gp120对D407细胞氧化应激的影响
1.目的：
观察gp120对体外培养的D407细胞氧化应激水平的影响，测定各种氧化应激酶活性的变化，以及对一氧化氮合酶和II型超氧化物歧化酶表达的影响。
2.研究方法：
2.1测定氧化应激酶活性的变化。分别对gp120的不同浓度组和不同处理时间组的D407细胞进行检测。取细胞匀浆检测一氧化氮，丙二醛和总抗氧能力的变化。
2.2采用免疫细胞化学方法，检测0.1μg/mlgp120处理D407细胞48小时后，诱导型一氧化氮酶在细胞表达的变化。
2.3检测iNOS在D407细胞在mRNA转录水平的变化。采用SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR方法检测iNOSmRNA。
2.4使用WesternBlot检测gp120不同浓度和不同时间处理组的D407细胞在iNOS和SOD-Mn蛋白质表达水平的变化。
3.研究结果：
3.1gp120导致细胞T-AOC降低，NO和MDA增加，其中NO在第48小时测定最高值，具有剂量依赖性；T-AOC和MDA变化趋势均具有时间、剂量依赖性。
3.2未处理的D407细胞iNOS表达呈阴性，处理后部分在细胞浆、细胞核及细胞膜有阳性表达。
3.3随着gp120浓度的增加，D407细胞的iNOSmRNA表达量增加，具有剂量依赖性。差异具显著性。
3.4WesternBlot结果显示，gp120导致D407细胞中iNOS及SOD-Mn蛋白表达量均增加，呈现时间、剂量依赖性。
4.结论：
Gp120导致D407细胞氧化应激，自由基生成增多、抗氧化能力下降，iNOS及SOD-Mn表达增加。
四、gp120对D407细胞间紧密连接的影响
1.目的：研究gp120对体内视网膜屏障功能以及体外培养D407细胞紧密连结功能和结构的影响。
2.研究方法：
2.1观察gp120对大鼠视网膜通透性的影响。使用SD大鼠，玻璃体腔注射2μg/1μlPBS的gp120，对照组为热灭活蛋白。24小时后股静脉注射伊文氏蓝，循环2-3小时后行心脏灌注，视网膜铺片，荧光显微镜下观察染料的渗透。
2.2建立视网膜外屏障体外模型，观察不同浓度组和不同时间组的gp120对体外D407细胞的跨上皮细胞电阻和FITC-白蛋白的通透率的影响。
2.3使用免疫细胞化学方法检测三种紧密连接蛋白在D407细胞的表达。透射电镜观察gp120处理后细胞间紧密连接在超微结构水平的改变。
2.4使用WesternBlot检测gp120不同浓度和不同时间处理组的D407细胞的三种紧密连接蛋白在蛋白质表达水平的变化。
3、研究结果：
3.1大鼠玻璃体内注射活性gp12024小时后，视网膜血管出现染料渗漏，视网膜组织间出现了多数点状高荧光的染料表达。
3.2gp120可导致D407细胞TER水平降低，单层D407细胞渗透率增加，具有时间、剂量依赖性。在由低到高gp120的不同浓度组，各组差异具有统计学意义。
3.3免疫细胞化学方法检测三种紧密连接蛋白在D407细胞的胞膜、胞浆均有表达。透射电镜观察gp120处理后细胞间紧密连接结构较对照组减少。
3.4WesternBlot检测gp120下调了D407细胞ZO-1和Claudin-1在蛋白质水平的表达，具有时间和剂量依赖性。对Occludin没有观察到明显的抑制效应。
4.结论：
HIV-1gp120导致视网膜屏障功能损害，其损害机制与RPE细胞间紧密连接破坏有关，具体表现在：体外培养的D407跨上皮细胞电阻下降，对白蛋白通透率增加，紧密连接蛋白水平下调以ZO-1和Claudin-1为主。
总结：
RPE细胞表达HIV-1辅助受体CXCR4和CCR5。游离的gp120可以导致RPE细胞氧化应激、超微结构破坏，造成细胞间紧密连接结构受损，并进而破坏细胞功能，最终引起血-视网膜屏障功能障碍。gp120对视网膜细胞的毒性作用可能在HIV-1视网膜病的发病机制中具着重要作用。
获得性免疫缺陷综合征;艾滋病;视网膜;上皮细胞;分子机制;眼部并发症;发病机制;动物模型
中山大学
博士
眼科学
张振平
2007
中文
R512.91;R774.1
90
2009-04-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）