TEM型超广谱β-内酰胺酶的体外定向进化研究
目的：
应用DNA家族改组方法提高TEM型超广谱β-内酰胺酶的活性，预测三级结构来探讨TEM型ESBLs结构与活性的关系，为新型β-内酰胺类抗菌素清除剂的研制打下基础。
方法：
1.blaTEM突变文库的构建、筛选和序列测定经DNA家族改组获得与原基因大小相同的改组后基因，将其克隆入原核表达质粒pET28a(+)，构建突变文库。利用酶的催化特点建立了基于平皿初筛和琼脂稀释法复筛的筛选体系，该筛选系统以最低抑菌浓度为指标。对活性增高菌株blaTEM基因进行序列测定，并预测分析其蛋白质三级结构。
2.重组质粒pET28a-blaTEM-3和pET28a-blaTEMm-2在大肠杆菌中诱导表达及其优化将重组质粒pET28a-blaTEM-3和pET28a-blaTEMm-2(从突变株MutE-11获得)转化入EcoliBL21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析。在不同条件下(诱导温度、诱导时间和IPTG浓度)诱导表达后比较不同条件下重组蛋白表达情况，以选择最佳的诱导条件。
3.重组TEM-3型ESBL和FEMm-2ESBL包涵体的复性和纯化及其酶动力学分析大量表达分离重组TEM-3型ESBL和TEMm-2ESBL包涵体，并用2mol/L，尿素和1％TritonX-100反复洗涤。以8mol/L尿素溶解包涵体，将包涵体裂解液上样于弱阴离子交换柱DEAESepharoseFF，进行柱上复性，复性产物进一步用分子筛SephadexG-75纯化。复性纯化产物进行酶动力学分析，比较改组前后酶动力学变化情况。
结果：
1.突变文库的筛选及突变株的序列分析经过一轮DNA家族改组成功构建突变文库，并筛选获得两株耐药性增加的突变株MutE-7和MutE-11，MutE-7菌株耐药性增高不明显，除CAZ对其MIC较对改组前的菌株有4-8倍增加外，其他抗生素对其MIC没有变化，其核苷酸序列有7个碱基替换，氨基酸改变为E104K，R164S：而对于MutE-11菌株，耐药性增高表现为MIC值增高2-4倍(AMP)、4-8倍(CEZ)、4-8倍(CXM)、16-32倍(CAZ)、8倍以上(CRO)和4-8倍(CTX)，其核苷酸序列有7个碱基替换，氨基酸改变为S59G，R164S，A237T和E240K。
2.重组质粒在原核系统中的诱导表达及优化重组菌pET28a(+)-blaTEM-3/BL21(DE3)和pET28a(+)-blaTEMm-2/BL21(DE3)在EcoliBL21(DE3)中上清表达较少，主要以包涵体形式表达，通过优化诱导条件显示IPTG浓度为0.1mmol/L、诱导温度为30℃、诱导时间4h以上能高效表达TEMm-2ESBL。
3.TEM-3型ESBL和TEMm-2ESBL包涵体的复性和纯化及酶动力学分析变性的重组TEM-3型ESBL和TEMm-2ESBL包涵体经阴离子交换层析柱DEAESF.F.柱上复性、纯化和分子筛SephadexG-75进一步纯化后纯度达90％。改组前后TEM型ESBL酶动力学分析结果显示，经DNA家族改组TEMm-2ESBL对β-内酰胺类抗生素的催化效率有不同程度的改变，与改组前TEM-3型ESBL相比对青霉素G和氨苄青霉素的Kcat/Km分别增高1.5倍和4.4倍，对头孢唑啉和头孢他啶的Kcat/Km分别增高3.1倍和2.8倍，而对头孢曲松和头孢噻肟的Kcat/Km却分别降低了1.7倍和2.5倍。
结论：
改组后菌株的TEM型ESBLs活性提高，DNA家族改组是一种有效地改善酶活性的体外定向进化技术。通过分析TEM型ESBLs结构与效应的关系，有助于研究TEM型ESBLs的作用机制，并为新一代β-内酰胺类抗生素及其清除剂的研制提供理论依据。
TEM型超广谱β-内酰胺酶;体外定向进化;blaTEM基因;突变文库;酶活性
温州医科大学;温州医学院
硕士
临床检验诊断学
吕建新
2008
中文
Q556.4
75
2009-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）