肺炎克雷伯菌耐药质粒pKF3-70和pKF3-90序列的测定及分析
[目的]：
1.本研究主要从基因组水平研究临床主要病原菌-肺炎克雷伯菌的质粒DNA的结构；
2.进一步分析质粒所携带的功能基因，研究质粒与宿主菌的耐药性和致病性等的关系；
3.为以后分析肺炎克雷伯菌的质粒谱、质粒DNA结构的演变规律和分子进化打下基础。
[方法]：
1.参照《全国临床检验操作规程》，并经法国生物梅里埃公司(bioMerieux)Vitek60细菌鉴定仪鉴定，我们从温州医学院附属第一医院临床送检的血液、腹水、尿液等体液中分离得到2006年2月-8月24株肺炎克雷伯菌。
2.采用碱裂解法提取质粒DNA，电泳分析细菌的质粒谱，选取含大质粒多重耐药性菌株为待研究菌株。
3.大量提取选定菌株的质粒DNA；构建质粒基因组小片段文库FOESMID文库并测序。
4.采用美国华盛顿大学提供的Phred/Phrap/Consed软件包进行序列拼接，然后用美国TIGR研究所提供的Gliminer软件预测ORF，进一步对这些基因进行功能分析。
5.利用Blast软件进行序列同源性比较、Clustal软件进行系统进化树构建。
[结果]：
1.成功构建了一个包含所有质粒DNA的大小为2-3kb的pUC18文库和35-40kb片段大小的FORSMID文库。
2.测序拼接后得到3个环状双链DNA质粒：其中pKF3-70的大小为69，477bp，G+C平均百分含量为52.4％，预测共编码92个ORFs，编码序列占整个基因组的78.3％，在这92个ORFs中73.9％在已知数据库中有同源基因，能够赋予功能，15.2％的ORFs编码保守的假定蛋白，剩余10.7％的ORFs在已数据库里没有同源蛋白序列。pKF3-90测序大小为91，327bp，预测共编码114个ORFs，G+C平均百分含量为51.9％，编码序列占整个基因组的85.2％。预测的编码ORFs中，有49.1％ORFs在已知数据库中有同源基因，能够赋予功能，45.6％ORFs编码保守的假定蛋白，剩余5.3％ORFs在已数据库里没有同源蛋白序列。
3.在pKF3-70和pKF3-90上同时发现了耐药性基因(β-内酰胺酶)、和接合转移系统基因、可移动DNA元件等。其中pKF3-70编码了毒力相关基因(铁转运系统透过性酶基因等)，pKF3-90编码了毒力相关基因(hok基因、溶血素调控蛋白基因等)。
[结论]：
1.本文成功地分离并测序分析了临床重要病原菌肺炎克雷伯菌的质粒DNA全序列。
2.在这两个质粒上都出现有未知功能的蛋白，特别是在pKF3-90上有50.9％的编码蛋白是未知的，有可能是该细菌特有的蛋白，其功能还有待与我们进一步的研究。
3.在这2个质粒上都有编码一整套F质粒相关的接合转移系统基因(F-tra系统基因)，表明这2个大质粒可在不同菌种或菌株中进行接合转移。
4.这2个质粒都编码耐药性相关基因和毒力相关基因等，由于这2个质粒都是可接合转移质粒，可以将耐药基因在细菌间进行基因水平转移，这样造成了耐药菌的播散，给人类的健康带来了威胁。
5.分析临床重要病原菌的功能性质粒，无论对于研究细菌耐药性机理和致病机理，或是指导临床合理用药，都具有重要意义。
肺炎克雷伯菌;质粒DNA;耐药质粒;耐药性;致病机理;pKF3-70序列;pKF3-90序列
温州医科大学;温州医学院
硕士
临床检验诊断学
包其郁;李劲松
2008
中文
R378.996
55
2009-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）