临床常见革兰阴性菌Ⅰ类整合子结构与功能的研究
目的：
1.调查随机选取的温州医学院附属第一医院分离的179株肺炎克雷伯菌和107产株超广谱β-内酰胺酶革兰阴性菌对临床常见抗菌药物的敏感性；
2.分析温州医学院附属第一医院分离的临床常见革兰阴性菌中Ⅰ类整合子分布；
3.探讨Ⅰ类整合子介导的耐药性机制和耐药基因播散的分子机制，为临床合理使用抗菌药物提供实验依据；
4.分析Ⅰ类整合子可变区结构与功能及常见基因盒的分子进化关系；
5.分析本实验室完成的一株肺炎克雷伯菌(F03株)质粒全序列中Ⅰ类整合子的结构构与功能。
方法：
1.按《全国临床检验操作规程》分离细菌，采用法国生物梅里埃公司VITEK60细菌鉴定仪鉴定细菌；利用E试验(E-test，浓度梯度琼脂扩散试验)进行药物MIC测定；
2.参照Ⅰ类整合子序列(AM939644)，利用Primer3软件在序列保守区设计Ⅰ类整合子特异性引物扩增Ⅰ类整合子可变区；
3.PCR扩增、DNA自动测序及Phred/Phrap/Consed软件包拼接，用美国TIGR研究所提供的Glimmer3软件预测ORF，以分析Ⅰ类整合子可变区基因盒结构；
4.利用ClustalX和mega3软件分析Ⅰ类整合子基因盒耐药基因的分子进化关系；
5.用Glimmer3及相关生物信息学软件预测本实验室完成的一株肺炎克雷伯菌质粒(pKF3-147)全序列上Ⅰ类整合子，详细分析该质粒携带的Ⅰ类整合子结构与功能。
结果：
1.药敏试验结果：1)肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率最高，对丁胺卡那和泰能的耐药率最低。上述细菌绝大部分为多重耐药菌株；2)不同年代肺炎克雷伯杆菌的耐药率的比较发现：从2004年到2006年，对哌拉西林、头孢他啶、庆大霉素、复方新诺明耐药率逐年升高，而从2006年到2007年却呈现下降趋势；3)在四种不同ESBL阳性菌中鲍曼不动杆菌多重耐药情况最严重。
2.各种革兰阴性菌中均有Ⅰ类整合子的检出，检出的整合子大小、结构存在多种类型；肺炎克雷伯菌的Ⅰ类整合子在不同年代的检出率不同，从2002年至2005年间呈上升趋势，2005年至2007年呈下降趋势；不同ESBL阳性的四种革兰阴性菌中，鲍曼不动杆菌中Ⅰ类整合子的检出率最高。
3.本研究发现的基因盒主要有6种不同类型，分别介导细菌对氨基糖苷类、链霉素、氯霉素及磺胺类药物的耐药，未发现常见的耐β-内酰胺类药基因盒。其中以链霉素腺苷酰转移酶基和二氢叶酸还原酶基因(ctg14a、14b、18、20)出现频率最高，占33.0％(32/97)。整合子可变区存在上述单个基因，也有存在多个基因之间的组合，本研究发现有5种不同的组合方式，其中以dfr、sad组合(ctg14a、14b、18、20、21)最为常见占56.7％(55/97)，aac(6’)、cat(4’)、.sad(3”)组合(ctgllb)次之，占19.6％(19/97)。同一耐药基因盒及同一基因组合可以出现在不同的革兰阴性菌中，同一菌株中可以存在多种耐药基因盒和多种不同的基因组合方式。
4.对二氢叶酸还原酶基因系统发生分析，可以发现Ⅰ类整合子所携带的二氢叶酸还原酶基因可分成4个组，分别与二氢叶酸还原酶基因第15型、5型、7型和13型基因较接近。
5.对多重耐药且ESBL阳性的肺炎克雷伯菌中F03株上3个大质粒进行质粒DNA全序列的生物信息学分析，发现其中大质粒(pKF3-147)上存在携带二氢叶酸还原酶基因和链霉素腺苷酰转移酶基因的Ⅰ类整合子，与该菌中检测出的Ⅰ类整合子PCR产物测序结果一致。
结论：
1.肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率最高，对丁胺卡那和泰能的耐药率最低。本研究中绝大部分为多重耐药菌株，ESBL阳性菌中多重耐药现象严重，且鲍曼不动杆菌检出率最高。
2.Ⅰ类整合子广泛存在于该院临床常见革兰阴性菌中。02到07年间，05年Ⅰ类整合子的检出率最高。在四种ESBL阳性菌株中，鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子的检出率最高。
3.Ⅰ类整合子可变区主要携带氨基糖苷类、氯霉素、磺胺类药物的抗性基因，以氨基糖苷类耐药基因最多见，未发现耐β-内酰胺酶基因。
4.二氢叶酸还原酶基因主要为第15型、5型、7型和13型相关基因。
5.肺炎克雷伯菌中F03株上大质粒(pKF3-147)上存在Ⅰ类整合子。
β-内酰胺酶;肺炎克雷伯菌;革兰阴性菌;Ⅰ类整合子;抗菌药物;敏感性;耐药基因
温州医科大学;温州医学院
硕士
临床检验诊断学
包其郁
2008
中文
R378.996
59
2009-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）