RNAi致DKK-1基因沉默的骨髓瘤细胞株对鼠胚胎成骨细胞分化的影响
目的：(1)建立RNAi后DKK-1基因长期沉默的人多发性骨髓瘤(MM)细胞RPMI8226细胞株；(2)研究RPMI8226细胞通过RNAi导致DKK-1基因沉默，DKK-1表达下降，减轻对小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1细胞分化成成骨细胞的抑制，初步探讨DKK-1在MM骨损发病中的作用。
方法：(1)设计1对DKK-1miRNA前体DNA寡核苷酸引物，退火成双链后克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR质粒，再通过GatewayR技术进行基因转移，得到重组质粒pLenti6/V5-GW/DKK-1-miR，与慢病毒包装质粒一起经lipofectamineTMM2000转染293FT细胞，48h后收获细胞上清液获得慢病毒，高速离心浓缩后感染RPMI8226细胞株，10μg/mlBlasticidin筛选12天得到DKK-1基因长期沉默的RPMI8226细胞株，RT-PCR检测胞浆DKK-1mRNA表达和Western-blotting检测浓缩50倍的细胞上清液中DKK-1蛋白的表达来分析DKK-1RNAi效率：(2)将RPMI8226原细胞株、DKK-1RNAi的RPMI8226细胞株和无关序列RNAi的RPMI8226细胞株等3种细胞培养上清液以20％体积比的量分别加入BMP-2诱导的MC3T3-E1成骨样细胞培养体系中，10天后观察3者对MC3T3-E1细胞分化成成骨细胞的抑制效率，观察指标为MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶(ALP)mRNA及活性的变化。
结果：(1)293FT细胞转染18小时后在荧光显微镜下整个培养板显现满视野绿色荧光，重组质粒转染效率90％左右；(2)慢病毒高速离心浓缩15倍后感染NIH3T3细胞，48h表达增强型绿色荧光蛋白(EmGFP)，流式细胞术检测NIH3T3细胞EmGFP表达率计算出慢病毒浓缩液滴度为3.89×105TU/ml；(3)分别用0、2、4、6、8、10μg/mlBlasticidin处理RPMI8226细胞12天，仅10μg/ml组没有存活细胞存在；(4)在8μg/mlPolybreneR作用下，0.5ml慢病毒浓缩液感染2×104个RPMI8226细胞，10μg/mlBlasticidin筛选12天后得到约2000个表达DKK-1shRNA的RPMI8226细胞克隆，细胞扩增后RT-PCR结果显示DKK-1mRNA表达降低了86％，Western-blotting结果显示DKK-1蛋白表达降低了88％；(5)MC3T3-E1细胞经50ng/mlBMP-2诱导10天后胞浆ALPmRNA表达增强6.9倍，ALP活性增强7.1倍；(6)跟单BMP-2诱导组相比，加入20％体积比的RPMI8226细胞培养上清液能强烈抑制MC3T3-E1细胞分化，培养10天后MC3T3-E1细胞ALPmRNA表达仅增强了2.2倍，ALP活性增强2.4倍。20％体积比的含DKK-1shRNA的RPMI8226细胞培养上清液抑制MC3T3-E1细胞分化能力减弱，10天后MC3T3-E1细胞ALPmRNA表达增强5.2倍，ALP活性增强5.5倍，分别跟单BMP-2诱导组和RPMI8226细胞组相比，差异均有统计学意义，P＜0.05。20％体积比的无关序列RNAi的RPMI8226细胞培养上清液培养10天后MC3T3-E1细胞ALPmRNA表达增强2，3倍，ALP活性增强2.6倍。
结论：(1)基于慢病毒载体的RNAi有较高的基因抑制效率，但缺点是产生慢病毒滴度低，需浓缩后才能感染靶细胞；(2)MM细胞通过分泌DKK-1抑制胚胎成骨细胞分化成成骨细胞，导致MM体内成骨细胞活性降低、数量减少，骨形成作用低于骨吸收作用，骨代谢失衡，最终导致骨质损伤：(3)RPMI8226细胞DKK-1RNAi后，其抑制胚胎成骨细胞分化能力减弱，说明基于慢病毒介导的RNAi是一种有效的治疗方法，具有良好的应用前景。
基因沉默;骨髓瘤细胞株;胚胎成骨细胞;细胞分化
温州医科大学;温州医学院
硕士
临床检验诊断学
俞康;吴建波
2008
中文
R733.3
53
2009-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）