三七皂苷影响动脉粥样硬化泡沫细胞形成的物质基础及其机制研究
动脉粥样硬化(AS)导致的心脑血管疾病是当今人类死亡的首要原因。虽然AS的概念已提出近百年，但其发病机制尚未完全明了。AS的发生是一个多种因素在多层次上综合作用的过程。血脂水平的升高伴随着促炎因子的表达和免疫反应的激活，单核细胞活化成为巨噬细胞，血管壁脂质过氧化导致大量ox-LDL生成，巨噬细胞通过吞噬ox-LDL及其一系列信号分子的表达导致脂质代谢的障碍，并最终形成泡沫细胞。泡沫细胞的形成是AS早期变化的特征性标志，巨噬泡沫细胞的形成及其作用是动脉粥样硬化斑块损伤形成、发展和崩解的关键。因此，在调脂抗炎的同时，影响巨噬泡沫细胞的形成作为AS治疗的新策略日益受到重视。
三七皂苷(PNS)是从三七根部提取的有效成分，主要含人参皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1等。我室既往的研究证实，PNS能通过炎症免疫调节、增加动脉粥样硬化斑块稳定性、抗自由基等机制发挥防治AS的作用。但是药物作用的物质基础及机制的不明确成为制约PNS充分、合理应用的重要因素。因此，立足于PNS的有效性，以现代药理研究方法和新技术为平台，我们以巨噬泡沫细胞形成这一脂质代谢和炎症反应相互交汇的AS早期事件为切入点，研究了PNS单体及其单体配伍对AS过程中泡沫细胞形成的影响，并探讨其可能的作用机制。
方法：
1.32只雄性日本大白兔，随机分成4组：对照组、AS模型组、PNS低剂量组、PNS高剂量组，分别用下列饲料喂养：(1)基础饲料，(2)高脂饲料，(3)高脂饲料+低剂量：PNS(60mg/kg)，(4)高脂饲料+高剂量PNS(120mg/kg)。实验周期12w。通过测定血清中TC、TG、LDL、MDA水平、SOD活性、主动脉苏丹Ⅳ染色及主动脉组织切片HE染色确定家兔AS模型的建立、泡沫细胞的形成及PNS的影响。
2.收集昆明种小鼠腹腔巨噬细胞，培养与纯化后，分为5组：(1)对照组，(2)模型组，(3)PNS低剂量组(20μg·ml-1)，(4)PNS中剂量组(40μg·ml-1)，(5)PNS高剂量组(80μg·ml-1)。各组细胞置5％CO2、37℃孵箱培养72h。油红O染色进行形态学观察，用酶法测定细胞内TC及FC，Lowry法测定细胞内蛋白质。
3.正交设计实验：根据预实验结果，选取皂苷单体Rg1、Rb1、R1为考察因素，每个因素各选择10-4、10-5、10-6M三个剂量为考察水平，以胆固醇酯为指标，进行正交实验，分别确定皂苷单体Rg1、Rb1、R1及其配伍对泡沫细胞形成的影响。
4.收集昆明种小鼠腹腔巨噬细胞，培养与纯化后，分为7组：对照组、模型组、PNS(80μg·ml-1)组、单体配伍组(含10-5MR1、10-5MRg1、10-6MRb1)、R1(10-5M)组、Rg1(10-5M)组和Rb1(10-6M)组。各组细胞置5％CO2、37℃孵箱培养72h。RT-PCR方法测定巨噬细胞内ACAT-1mRNA、AdipophilinmRNA、ABCA1mRNA、CD36mRNA和LXRαmRNA表达；用Westernblot方法测定巨噬细胞内CD36蛋白表达。
结果：
1.AS模型兔主动脉内膜下大量泡沫细胞积聚，动脉粥样硬化斑块面积显著增加；高剂量PNS可明显减少泡沫细胞的形成，降低动脉粥样硬化斑块面积(p＜0.01)。
2.AS模型组家兔血清中TC、TG、LDL-C水平均显著高于对照组(p＜0.01)；与AS模型组相比，高剂量PNS能非常显著降低TC、TG、LDL-C水平(p＜0.01)，低剂量PNS能显著降低家兔血清中TC水平(p＜0.05)，TG、LDL-C水平无统计学差异(p＞0.05)。
3.AS模型组动物血清中MDA水平明显升高(p＜0.01)，SOD活性明显下降(p＜0.01)；PNS高剂量组血清中MDA水平明显低于AS模型组(P＜0.01)，而SOD活性显著升高(p＜0.01)；PNS低剂量组血清中MDA水平低于AS模型组(p＜0.05)，而SOD活性无明显升高。
4.体外培养的巨噬细胞，未经处理的细胞形态多呈梭形，油红O染色无着色；与ox-LDL共培养后，油红O染色阳性细胞遍布，且细胞体积明显增大，形态多呈圆形或不规则形；PNS中、高剂量组细胞油红O染色阳性细胞比模型组明显减少，形态渐趋正常，而PNS低剂量组细胞与模型组相比无明显变化。
5.模型组细胞内TC、FC、CE水平呈显著高于对照组(p＜0.01)，且CE/TC有显著性差异(p＜0.01)；与模型组相比，PNS高、中剂量组细胞内TC、FC、CE水平及CE/TC均有显著性降低(p＜0.01)，PNS低剂量组除TC、CE显著降低外(p＜0.01)，其它无明显变化；PNS各剂量组间细胞内TC、FC、CE水平及CE/TC均有显著性差异(p＜0.01)。
6.正交实验表明，皂苷单体R1、Rg1、Rb1效应均显著，并且R1×Rb1和Rg1×Rb1的交互作用显著(p＜0.01)，其最佳单体配伍组合是：Rg1:R1:Rb1=10-5:10-5:10-6M。
7.PNS单体配伍能显著降低与ox-LDL共培养巨噬细胞中CE/TC(％)值，与高剂量PNS相比无显著差异。
8.0x-LDL诱导巨噬细胞CD36mRNA表达显著增加(p＜0.01)；PNS组和单体配伍组均能非常显著地降低CD36mRNA表达(p＜0.01)，Rg1、R1组可显著降低CD36mRNA表达(p＜0.05)，Rb1组无显著性差异(p＞0.05)；与PNS组相比，单体配伍组、Rg1组、R1组无显著性差异。
9.0x-LDL诱导巨噬细胞AdipophilinmRNA表达显著增加(p＜0.01)；与模型组相比，PNS组、单体配伍组、Rg1、Rb1、R1组AdipophilinmRNA的表达与模型组无显著差异。
10.模型组LXRαmRNA表达显著增加(p＜0.05)；PNS组和单体配伍组、Rg1、R1组均能非常显著地增加LXRαmRNA表达(p＜0.01)，Rb1组无显著性差异(p＞0.05)；与PNS组相比，单体配伍组无显著性差异(p＞0.05)，Rg1组有显著性差异(p＜0.05)，R1、Rb1组有非常显著差异(p＜0.01)。
11.模型组ABCA1mRNA表达较对照组显著增加(p＜0.05)；与模型组相比，PNS组、单体配伍组均能非常显著地增强ABCA1mRNA表达(p＜0.01)，R1组可显著增加ABCA1mRNA表达(p＜0.05)，且三组之间无显著差异。
12.模型组ACAT-1mRNA表达显著增加(p＜0.01)；PNS组、单体配伍组和Rb1组均能非常显著地降低ACAT-1mRNA表达(p＜0.01)，且三组之间无显著性差异。
13.模型组CD36蛋白表达明显高于对照组(p＜0.01)；PNS组与单体配伍组CD36蛋白表达量较模型组有显著性降低(p＜0.01)，Rg1、R1组CD36蛋白表达量较模型组明显减少(p＜0.05)；与PNS组相比，单体配伍组、Rg1组和R1组无显著性差异(p＞0.05)。
结论：
1.PNS通过减轻氧化应激、调节血脂水平和抑制巨噬细胞吞噬功能，防治家兔实验性AS和泡沫细胞的形成。
2.PNS、PNS单体配伍均能抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成。
3.PNS与PNS单体配伍下调ox-LDL诱导的CD36mRNA、ACAT-1mRNA表达及CD36蛋白表达，上调ABCA1mRNA、LXRαmRNA的表达；Rg1可下调CD36mRNA及CD36蛋白表达、上调LXRαmRNA表达；Rb1下调ACAT-1mRNA表达；R1下调CD36mRNA及CD36蛋白表达、上调ABCA1mRNA、LXRαmRNA的表达，从而减少巨噬细胞内胆固醇蓄积，促进其外流，从不同环节上影响泡沫细胞的生成。
4.本实验中，三七皂苷单体Rg1、Rb1、R1最佳配伍是：R1:Rg1:Rb1=10-5：10-5:10-6，单体配伍对泡沫细胞的作用与PNS相当。因此，推测Rg1、Rb1、R1是PNS影响泡沫细胞形成的主要物质基础。
动脉粥样硬化;三七皂苷;巨噬细胞;泡沫细胞
第三军医大学
博士
药理学
李晓辉
2007
中文
R541.4;R282.71
98
2009-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）