生长抑素对脓毒症肺损伤的保护作用及机制探讨
研究背景：
脓毒症是感染、创伤、大手术后和休克等常见的并发症，是危重患者死亡的重要原因。脓毒症可导致多脏器的损伤，在这些受损伤的脏器中，肺脏最易受到各种致病因素的打击，成为机体失控炎性损害的主要靶器官，这是由于肺脏不仅是气体交换的器官，也是一些细胞因子和激素等产生和灭活的场所。各种途径入血的毒素、内源性炎性介质等物质经静脉回流后首个流经的重要脏器就是肺脏，加上肺脏本身在解剖结构上相对较脆弱，肺循环具有压力低、流速慢、面积大的特点，增加了肺脏实质细胞对毒性物质的暴露机会和时间。因此，在诸多脏器中，肺脏也因而成为功能不全发生率最高和发生时间最早的器官，并表现为急性肺损伤或/和急性呼吸窘迫综合征。
关于脓毒症致肺损伤的确切发病机制还不清楚，研究认为，急性肺损伤不仅是肺部疾病，也是全身系统炎性疾病的肺部表现，炎性反应和免疫调节失控导致多形核白细胞、肺泡巨噬细胞等炎性细胞激活，引起多种促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子-α、白介素-1β等释放，并通过细胞间的信息传导，炎性反应级联放大，导致肺损伤加重、免疫系统功能破坏，甚至发展为多器官功能障碍综合征。多形核白细胞、巨噬细胞等是炎症反应的效应者和执行者，近来研究表明：在巨噬细胞及中性粒细胞上表达的髓样细胞触发性受体1作为细菌和真菌急性炎症反应的触发器和放大剂的角色已受到人们的关注。在细菌感染早期TREM1在单核细胞上的活化具有通过参与免疫反应来帮助宿主抵抗微生物侵犯的作用，它能诱使几种炎性因子和化学因子如肿瘤坏死因子-a、白介素-8和单核细胞趋化蛋白-1的生成。在细胞内部，TREM1可激活中性粒细胞脱颗粒，诱发钙离子转移，并使细胞表面信号相关激酶1，2和磷脂酶C酪氨酸磷酸化，TREM1连同跨膜受体分子DAP12共同调节该活化过程，最终可引起炎症反应的增强、放大，导致“过度”的炎症反应。在LPS诱导的休克，腹腔注射活的大肠杆菌和盲肠结扎穿孔的急性细菌炎症动物模型中发现，采用可溶性TREM1IgG融合蛋白阻断TREM1信号减少过渡的炎症反应和死亡，进一步证实TREM1具有防大炎症反应的作用。而在细菌感染期间，TREM1还具有促进炎性因子分泌的作用，当DAP12在肺中持续的高表达，TREM1、TREM2分子被诱导出，它们动态的表达促进促炎细胞因子的释放。这些提示鉴于TREM1在启动和增强炎症反应中的关键作用，在机体诸如脓毒症和急性肺损伤等过度的炎症反应为特征的疾病，TREM1可作为潜在的治疗靶点，调节TREM1的信号可以帮助改善脓毒症和急性肺损伤患者的预后。
生长抑素及其类似物是临床治疗急性胰腺炎的有效药物，已有研究提示其对重症胰腺炎致肺损伤的治疗作用机理与抑制免疫活性细胞功能及双向调节炎症反应有关。但是对于同是过度炎症反应状态的脓毒症肺损伤，生长抑素是否产生相同的治疗作用，而且其信号转导路径如何，未见相关报道。而近年研究表明细胞因子信号转导中的一个新途径，JAK-STAT信号转导通路，在组织受伤和感染时释放的细胞因子使其通路中相应的因子活化并表达升高，过度激活JAK-STAT通路诱导炎症细胞生成大量的磷酸化JAK和磷酸化STAT已成为内毒素致肺脏损伤机制的新解释，但相关研究不多。所以本研究拟利用小鼠盲肠结扎穿孔术致脓毒症肺损伤的动物模型，从动物模型和分子水平观察生长抑素治疗脓毒症肺损伤后氧分压、肺湿/干比、髓过氧化物酶(MP0)、病理学指标以及细胞因子TNF-α的变化，并观察TNF-α、IL-1β及TREM1的基因表达变化、TREM1蛋白表达水平以及JAK-STAT的信号通路变化，旨在阐明生长抑素治疗脓毒症肺损伤的机制，为脓毒症肺损伤的预防和临床救治提供一种新的研究思路。
研究目的：
1.观察生长抑素对脓毒症致肺损伤小鼠血氧分压、肺湿干比、肺髓过氧化物酶(MPO)、炎性细胞因子TNF-α水平及肺组织病理的影响，探讨生长抑素对脓毒症肺损伤的保护性作用。
2.观察生长抑素对脓毒症肺损伤小鼠肺组织TREM1、TNF-α、IL-1β基因表达及TREM1蛋白表达水平的影响，在分子水平探讨生长抑素对脓毒症肺损伤的保护机制。
3.观察生长抑素干预对脓毒症肺损伤小鼠肺组织Jak-Stat信号通路的影响，旨在探讨生长抑素对脓毒症肺损伤的保护作用信号转导机制。
研究内容：
第一部分：生长抑素对脓毒症小鼠肺损伤的保护作用
采用盲肠穿孔方法复制脓毒症肺损伤模型。50只雄性昆明小鼠随机分为5组：正常对照组，假手术组，脓毒症组，生长抑素治疗1组，生长抑素治疗2组，每组10只。生长抑素1组小鼠ALI后0h、6h时间点皮下注射生长抑素50mg/kg(浓度5mg/ml)，生长抑素2组为100mg/kg(浓度10mg/ml)，其余组小鼠注射等量的生理盐水。于模型成功后12h点，采用左心室穿刺采集小鼠动脉血测定血氧分压；采用4％中性福尔马林液固定肺组织，进行HE染色后进行病理评分；采用ELISA法检测12h血浆TNF-α水平；采用分光光度比色法测定肺组织髓过氧化物酶的活性。
第二部分：生长抑素对脓毒症肺损伤小鼠TREM1表达的影响
脓毒症肺损伤模型同第一部分，在致伤后12小时取材，处理标本。Trizol法提取肺组织总mRNA后，RT-PCR分析TREM1、TNF-α、IL-1βmRNA表达水平；采用流式细胞术检测各组小鼠肺灌洗液中中性粒细胞表面TREM1蛋白的表达；免疫组织化学法检测各组小鼠肺组织TREM1的表达，并采用光密度软件分析小鼠肺组织TREM1的表达变化；全细胞裂解法提取各标本总蛋白后，Westernblot法检测各组肺组织中TREM1蛋白总含量；结合第一部分肺湿干比、髓过氧化物酶的活性，进行相关分析。
第三部分：生长抑素对脓毒症肺损伤小鼠Jak-Stat信号转导通路的影响
采用盲肠穿孔方法复制脓毒症肺损伤模型。9只昆明雄性小鼠随机分为3组：假手术组，脓毒症肺损伤组，生长抑素治疗组，每组3只。生长抑素组小鼠ALI后0h、6h时间点皮下注射生长抑素100mg/kg，浓度10mg/ml)，其余小鼠注射等量的生理盐水。于模型成功后12h点，处死小鼠获取肺组织液氮保存用于基因芯片测定Jak-Stat信号通路的基因表达差异。
研究结果：
第一部分：生长抑素对脓毒症肺损伤小鼠的肺保护性作用
各组小鼠12h时点氧分压数据经单因素方差分析，结果显示组间氧分压差异有显著性(F=16.038，P=0.000)。进一步经组间多重比较LSD法分析，结果显示与正常对照组(99.4±8.5)和假手术组(98.5±6.6)相比，生长抑素治疗SS1组(89.2±8.7)PaO2降低差异有显著性(P<0.01)，SS2(93.3±7.1)组小鼠PaO2稍低，但差异无显著性(P>0.05)；而与ALⅠ组相比，SS1及SS2治疗组小鼠PaO2升高差异有显著性(P<0.01)，提示不同治疗方法随组别的不同，PaO2变化不同。说明ALI致伤小鼠以后，发生肺间质水肿以及肺泡上皮损伤，从而影响气体交换，导致血氧下降，而SS治疗则具有提高脓毒症肺损伤时PaO2的作用。
第二部分：生长抑素治疗肺组织TREM1、TNF-α、IL-1βmRNA表达的影响
经单因素方差分析及组间多重比较LSD法分析，结果显示与Ctrl组(0.065±0.035)和Sham组(0.067±0.032)小鼠肺组织TREM1mRNA表达比较，生长抑素治疗SS1组(0.400±0.033)及SS2组(0.374±0.037)表达升高差异有显著性(P<0.01)，而与ALⅠ组(0.596±0.066)比较，SS1、SS2组表达下降差异有显著性(P<0.01)。提示脓毒症肺损伤12h时点TREM1mRNA表达升高，而生长抑素具有抑制TREM1基因转录的作用。
第三部分：生长抑素对脓毒症肺损伤小鼠Jak-Stat信号转导通路的影响
通过脓毒症术后12h肺组织的基因芯片分析，结果发现(1)脓毒症术后12h，有57个基因出现差异表达，其中表达上调者40个，下调者17个。其中涉及到JAK/STAT通路的基因、耦联及激活Jak蛋白的受体、核转位、Stat蛋白磷酸化、转录正性/负性调节、信号传导激活、免疫反应、凋亡等。从上调及下调基因功能的差别看，上调基因如Jak2、Cxc19、I120、Nos2、Stat1、Stat3等主要是正性调节信号传导转录激活、炎症反应、抗凋亡基因等基因，下调基因主要是负性调节转录因子的激活、促进凋亡的基因、抑制免疫反应及炎症反应的基因等。上游信号通路不同功能的转录信号差异从一定程度上启动了下游促炎细胞因子的信号的转位、复制，转录激活的不同，导致了促炎细胞因子与抑炎细胞因子的不平衡，这可能是脓毒症机体促炎因子与抗炎因子之间的平衡发生变化的根本原因。
结论：
生长抑素能明显抑制脓毒症肺损伤小鼠肺中性粒细胞等炎性细胞表面髓样细胞触发受体1基因的转录及蛋白的表达，影响其下游的Jak-Stat信号传导通路，调节下游促炎/抑炎介质的平衡，防治脓毒症肺损伤所致的过度炎症反应状态，减轻炎性细胞的浸润和组织水肿，进而发挥肺保护作用。
生长抑素;肺损伤;保护作用;治疗机制;脓毒症
南方医科大学
博士
外科学
古妙宁
2008
中文
R631
105
2009-03-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）