大肠杆菌O157喹诺酮类耐药相关机制的研究
大肠杆菌0157：H7是医学和兽医学临床感染中常见的病原菌之一，建立快速检测方法对食品安全和人类健康具有重要意义。大肠杆菌0157对多种抗菌药物耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为AcrAB-AB-TolC外输泵是最主要的外输泵，能够输出多种抗菌药物、化疗试剂、洗涤剂和染料类。如果使该系统失活，大肠杆菌0157可从多重耐药状态变为相对敏感状态。本实验通过建立大肠杆菌0157：H7的快速检测方法，研究大肠杆菌0157：H7对氟喹诺酮类药物的基因突变耐药机制，检测临床分离的动物源性大肠杆菌0157的acrA、acrB基因的mRNA和蛋白的表达水平，寻找acrA、acrB基因的表达水平与大肠杆菌0157多重耐药水平的相关性。
研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌0157：H7的多重PCR、荧光定量PCR方法并比较单一PCR和多重PCR、荧光定量PCR对检测灵敏度的影响。选择0157：H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的4对引物，分别或共同进行PCR扩增，检测24株0157：H7和非0157：H7菌株，将细菌稀释后比较PCR的检测灵敏度。同时设计TaqMan荧光探针进行荧光定量PCR进行灵敏度检测。所有0157：H7菌株均在497bp和625bp处出现0157抗原基因和H7抗原基因产物，其产毒株在484bp和(或)210bp处出现SLT1和(或)SLT2基因产物，非0157：H7菌株PCR结果均为阴性：单一PCR检测，灵敏度为150CFU/PCR反应，多重PCR为>1500CFU/PCR反应，而荧光定量PCR为14CFU/PCR反应。
选用临床分离的4株耐药菌、实验室诱导培养获得的3株耐药菌和1株敏感菌，提取其染色体DNA，PCR扩增gyrA和parC基因片段，并将其克隆和测序。结果表明，无论是临床分离的还是实验室诱导的耐药菌，gyrA基因在其编码第83位或第87位氨基酸处均发生突变，parC基因在其编码第80位或第84位氨基酸处发生突变，而敏感菌ES在2个基因位点上均未发生突变。其中2株低度耐药菌株的gyyA基因出现单一突变，使其编码的氨基酸发生改变，分别为Ser83ULeu或Asp87UAsn，但在parC基因上却未发生突变：其余5株高度耐药菌gyrh基因突变导致氨基酸发生改变：Ser83-Leu，Asp87UAsn和Tyr，其中两株parC基因突变导致氨基酸改变：Ser80-11e和GIu84-Lys。这2个基因的突变均与文献报道的突变相同，表明gyrA基因Ser83和Asp87突变以及part基因Ser80和GIu84突变可能与大肠杆菌0157的氟喹诺酮类药耐药机制有关，且低度耐药只在gyrA基因上出现单一位点突变，当高度耐药时，才同时在parC基因上出现突变，gyrA，parC是大肠杆菌0157：H7耐氟喹诺酮类药物的基因标识。
多重耐药大肠杆菌0157acrA、acrB基因的mRNA的水平比较，将耐药株的反转录产物量相当的内参稀释度与大肠杆菌0157 EDL933的反转录产物量相当的内参稀释度做比较的结果表明：高水平耐药与EDL,933菌株的acrA、acrB的mRNA水平相比较提高4-8倍：中度耐药的大肠杆菌0157的acrA、acrB的mRNA水平与EDL933的acrA、acrB的mRNA水平相比提高1-2倍，低水平耐药与EDL933的acrA、acrB的mRNA水平相当。与EDL933的acrA、acrB基因的mRNA的水平相比，同一菌株的acrA、acrB基因的mRNA的水平基本一致，可能是由于二者由一个操纵子调控的原因。acrd、acrB是大肠杆菌0157：H7多重耐药的基因标识，其mRNA转录水平与大肠杆菌0157：H7的多重耐药水平呈正相关性。
本研究结果表明，多重PCR和荧光定量PCR可对大肠杆菌0157：H7进行定性定量检测：大肠杆菌0157：H7gyrd基因、Ser83和Asp87突变以及parC基因Ser80和G1u84突变可能与大肠杆菌0157的喹诺酮类药耐药机制有关，且低度耐药只在gyrA基因上出现单一位点突变；当高度耐药时，才同时在parC基因上出现突变。大肠杆菌0157：H7同一菌株的acrA与acrB基因的mRNA的水平是基本一致的：与敏感株相比，acrA的mRNA水平与其蛋白表达水平基本一致：多重耐药大肠杆菌0157的mRNA和蛋白表达水平与其耐药水平有一定的相关性。
大肠杆菌;快速检测;外输泵失活;耐药相关机制;氟喹诺酮类药物;基因突变
甘肃农业大学
硕士
预防兽医学
伏小平
2007
中文
R378.21;Q344.12
67
2008-12-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）