集胞藻转抗菌肽基因及硝酸还原酶缺失突变载体构建的研究
蓝藻又称为蓝细菌(cyanobacteria)，是一类光合自养型的原核生物，因其独特的性质被广泛应用于分子生物学领域的研究。近年来，随着对蓝藻分子遗传学的深入研究，通过重组DNA技术人工构建藻类新株系，以及生产蓝藻基因工程产物，成为蓝藻基因工程的两大目标，并取得了重大突破。
抗菌肽CM4是从中国家蚕蛹中分离到的具有最强生物活性的组分，由35个氨基酸组成。它具有广谱的抗细菌、真菌、病毒、原生动物和某些肿瘤的活性，并对水产致病菌也有较强的抑杀作用。但是天然的抗菌肽制备量少，纯度不够高。通过基因工程的方法，将抗菌肽CM4在集胞藻中进行表达，用作水产饵料，起到“食-药”合一的目的。这为解决防治水产品疾病和减少抗生素使用的矛盾提供了一条有效的途径，可获得巨大的经济效益和环境生态效益。
本研究是利用集胞藻作为受体，构建了包含表达单元pCΩ“启动子-抗菌肽CM4基因-终止单元”的整合载体pBS-S1-pCΩ，采用自然转化将目的基因转入集胞藻，获得了具有抗性的转基因藻。对得到的转基因藻进行的活性抑菌分析和PCR检测结果表明，pBS-S1-pCΩA株系已经能够成功表达出有活性的抗菌肽，是阳性转基因藻。
对转基因藻的生长情况测定表明，在常规培养条件下，pBS-S1-pCΩA藻株与野生藻的细胞密度和叶绿素含量类似。光合放氧测定的结果显示，pBS-S1-pCΩA藻株的光合放氧活性与野生藻相比，pBS-S1-pCΩA藻株提高了1 9.86％。说明基因修饰后转化得到的转基因藻有着良好的光能利用效率。
在转基因藻研究中，特别是利用藻作为生物反应器表达外源基因时，从大量未转化细胞背景中筛选并获得稳定转化子，必须依赖于有效的选择标记。目前，有关集胞藻选择标记的研究较少，主要有除草剂、抗生素抗性因子等研究。
集胞藻中的硝酸盐还原酶(nirtaterumdcaste，NR)作为限速酶，催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，这一过程在氮代谢中处于关键地位，对藻的生长发育、产量形成有重要影响。因此在转基因集胞藻的研究中，硝酸还原酶基因是更加安全的选择标记基因，对今后构建集胞藻遗传转化系统，使外源目的基因在其中稳定表达、生产目的基因产品具有十分重要的意义。本论文主要完成集胞藻硝酸还原酶完全缺失型突变重组载体pBS-SNF1-ks-SNF2的构建。该载体具有硝酸还原酶基因(narB)上游和下游的片段和自杀基因sacB。
蓝藻;分子遗传学;基因工程;抗菌肽;硝酸还原酶;基因突变;重组载体
南京师范大学
硕士
植物学
李建宏
2008
中文
Q949.221;Q943
60
2008-12-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）