禽呼肠孤病毒M1、M2基因克隆序列分析与病毒受体的确定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立
禽呼肠孤病毒(ARV)主要感染鸡和火鸡，在鸡群中普遍存在，常与其他疾病混合感染，临床上表现多种病症，导致鸡的生长能力下降及死亡率升高。为了更有效的预防和控制ARV，降低ARV对养禽业的危害，本课题开展了ARV M1、M2基因的克隆与序列分析及病毒受体的初步研究，并应用SYBR Green Ⅰ染料建立了ARV的荧光定量RT-PCR检测方法。
根据GenBank ARV M1、M2基因序列，设计两对引物，分别对9株ARV的M1、M2基因进行了RT-PCR扩增、克隆及序列测定。结果显示，所构建的克隆质粒中含相应的M1、M2蛋白基因完整ORF，大小分别为2199bp和2031bp，分别编码732和676个氨基酸的μA和μB蛋白；经分析，测序的9株ARV M1、M2基因核苷酸及其推导的氨基酸序列具有高度的同源性，M1基因在99.3％～99.7％和99.3％～99.7％之间，M2基因在98.7％～99.9％和97.8％～99.9％之间。与GenBank上其他呼肠孤病毒株包括美国分离株(2408)、日本分离株(OS161)和4株台湾分离株(1017-1、601G、750505、916SI)进行比较，结果表明所有毒株M1基因的核苷酸和氨基酸同源性都较高，分别在88.3％～100％和97.0％～100％之间；M2基因与2408株和1017-1株的核苷酸和氨基酸同源性高，均在98％以上，而与其他分离株的核苷酸和氨基酸同源性较低，仅在69.5％～72.0％之间和85.5％～89.5％之间；遗传进化树分析表明M2基因中多数台湾株和日本株变异大。
将培养的鸡胚成纤维细胞接种ARV S1133病毒株以增殖病毒，待细胞病变达60％-80％时收毒，冻融三次后通过差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化病毒，经紫外分光法测病毒蛋白浓度为6.25mg/mL。提纯鸡胚原代肝细胞膜蛋白测浓度为16mg/mL。取24uL浓度为16ug/uL的膜蛋白经SDS-PAGE电泳后，采用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)即膜蛋白电泳后转移到硝酸纤维素膜上依次与病毒、抗血清和酶标二抗作用显出病毒受体结合带的方法结合Bandscan分析病毒受体分子量为68.6kDa。
根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域设计一对扩增片断为147bp的特异性引物，将PCR扩增的σC基因片段，连接pGM-T载体，重组质粒经筛选、PCR鉴定及测序进一步证实，表明σC片段正确克隆入pGM-T载体中，命名为pGM-T-σC。提取质粒用Sal I单酶切得到线性化转录模板DNA，体外转录出RNA，以体外转录的RNA为标准品制定标准曲线，应用SYBR Green I染料建立了检测禽呼肠孤病毒的一步法荧光定量RT-PCR方法。结果表明，制作的标准曲线定量浓度范围宽，在5.2×102-5.2×109拷贝/uL之间呈良好的线性关系，可检测到每个反应相当于5.2×102个拷贝的标准品RNA；该方法特异性好，与NDV、IBDV、MG都不反应。
本课题开展了ARV M1、M2基因的克隆与序列分析及甩VOPBA鉴定了ARV受体的分子量，为进一步研究病毒各蛋白问的相互作用、病毒与宿主的相互关系及基因组与致病性的关系提供重要参考。应用SYBR Green I染料成功建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法，为ARV的流行病学、致病机理研究及快速诊断与防治等方面提供了重要的技术支撑。
禽呼肠孤病毒;M1基因;M2基因;基因克隆;基因序列分析;荧光定量RT-PCR方法
广西大学
硕士
预防兽医学
谢芝勋
2008
中文
S858.3
56
2008-11-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）