胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白的克隆表达及多重荧光PCR诊断方法的研究
猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种猪的高度接触性传染病，针对胸膜肺炎放线杆菌血清型众多，现有疫苗缺乏交叉保护力，对规模化养猪业造成巨大经济损失的现状，研究开发具有交叉保护力的新型疫苗迫在眉睫。研究发现Apx毒素是APP的主要保护性抗原，可提高疫苗灭活疫苗的保护作用。天然毒素提取产量低、过程繁琐且成本较高，利用体外克隆表达编码Apx毒素结构蛋白的基因，获得的重组蛋白与天然提取的毒素免疫原性无明显差异，可为下一步新型疫苗多肽成分和ELISA诊断抗原的研究做充分准备。apxIV是近年新发现的一个具有APP种属特异性的抗原，只存在于自然感染的动物体内，不会与其它放线杆菌和革兰氏阴性杆菌发生交叉反应。编码ApxⅣ毒素结构蛋白的apxⅣA基因C端特异性和保守性均很强，是首选的诊断抗原和靶基因。
本研究运用蛋白质软件Anthe 5.0分析了APP的两个关键毒力因子ApxⅠA和ApxⅡA的抗原性和亲水性，截取其中主要抗原位点相对集中的核心区域，分别从胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内参考株259和血清7型国内参考株265中扩增了apxⅠA和apxⅡA毒素基因，进行体外克隆，构建了原核表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA和pET32a/apxⅡA以及真核表达载体pPICZaA/apxⅠA；并用T4连接酶串连apxⅠA和apxⅡA基因，构建了该融合基因的原核表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA-apxⅡA；从胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内参考株259中扩增apxⅣA毒素C端特异和保守的一段基因，进行体外克隆，构建了原核表达载体pGEX-4T-1/apxⅣA。
以上四个原核表达载体分别在大肠杆菌DH5a、BL21和。Top10'F中以IPTG进行诱导表达，ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅠA-ApxⅡA及ApxⅣA在大肠杆菌中均以包涵体形式表达，表达的重组融合蛋白分别占菌体总蛋白的32％、23％、19％和40％，利用溶菌酶和超声波对重组菌进行分次裂解，除去大部分可溶的菌体蛋白，再用Glutathione Sepharose 4B或Ni-NTA对相应产物进行进一步过柱纯化，最终获得的重组融合蛋白纯度在92％9～8％之间，Westem-blot的结果表明以上蛋白均具有良好的反应原性，可直接用于ELISA诊断抗原或新型疫苗多肽成分的研究。
ApxlA的真核表达载体经甲醇诱导，在毕赤酵母GS115中以低水平分泌表达至培养液上清，经40倍浓缩才能检测到目的蛋白，同时从重组酵母总RNA中检测到apxⅠA基因的mRNA，可以证实目的基因发生了转录。经分析，造成apxⅠA基因在毕赤酵母系统中低水平表达的原因可能是：一、组成目的基因的密码子对于毕赤酵母的偏好指数极低；二、大量的酵母稀有密码子使得目的基因中tRNA丰度较低，导致翻译过程出现瓶颈效应；三、目的基因的高AT含量使酵母表达的转录提前终止。
猪传染性胸膜肺炎和猪圆环病毒Ⅱ型在临床上共感染较为普遍，都以侵害呼吸系统为主，根据胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因和猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因中最特异最保守的片段分别设计引物和荧光标记TaqMan探针，建立了可同时鉴别诊断猪传染性胸膜肺炎和猪圆环病毒Ⅱ型的实时定量荧光PCR方法，与其它经常发生混合感染的猪繁殖呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(HCV)、伪狂犬病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HP)、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌等病原体均无交叉反应。该方法用于检测APP和PCV2 DNA的敏感度分别达到1×101拷贝和1×100拷贝，并且在两种病原的模板浓度相差105个拷贝时仍可以同时被检出。建立了APP和PCV2两种单重的TaqMan探针荧光实时定量PCR检测方法。所建立的诊断方法快速便捷、特异性好、敏感度高，对早期的快速诊断和筛查以及病原的净化具有很高的实用价值。
猪胸膜肺炎;放线杆菌;蛋白表达;PCR诊断
广西大学
硕士
预防兽医学
谢芝勋
2008
中文
S858.28;S856.3
72
2008-11-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）