十字花科黑腐病菌锌吸收调控蛋白基因zur启动子的研究
在细菌中，锌吸收调控蛋白Zur(zinc uptake regulator)(由zur基因编码)的主要功能是当细胞内锌离子浓度过高时抑制锌吸收系统的表达。但是，本实验室的研究表明，在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv．campestris)中，zur(基因编号为XC1430)除了调控锌离子平衡外，还参与了该菌的致病过程和EPS产生。在完成zur基因的功能鉴定后，本实验室还对zur基因的启动子进行了初步研究，推测zur基因可能存在两个独立的启动子P1(基因组注释的ATG前面114 bp)和P2(基因组注释的zur基因读码框内，ATG下游63 bp处的另一个翻译起始密码子GTG前108 bp)。为了证实这一假设，本研究分别构建了启动子P1和P2与无启动子gusA基因的融合报告质粒pL6PlgusA和pL6P2gusA，并检测它们在野生型菌株8004中的GUS活性，结果表明，P1和P2均有启动子活性；进一步的实验研究结果表明P1和P2的表达均不受锌离子的影响。为了确定P1和P2的转录起始位点，我们进行了5'-RACE实验，结果表明在ATG上游23 bp处的A碱基是P1的转录起始位点，但是在我们所用的实验条件下没有检测到P2的转录起始位点。
由于GUS活性结果表明P1和P2都具有启动子活性，因此我们推测zur既可以从ATG起始也可以从GTG起始翻译，分别编码两种Zur蛋白即ZurL(从ATG起始)和ZurS(从GTG起始)。为了证实这一点，我们分别构建了带有翻译起始密码子ATG→ATA和GTG→GTA点突变的zur基因的质粒pL6zurATG和pL6zurGTG并分别导入zur的缺失突变体中，然后对点突变互补菌进行锌敏感性、EPS产量以及致病性进行检测。结果发现，将GTG点突变后(只能合成ZurL蛋白)，重组质粒pL6zurATG可以互补zur突变体的锌敏感、致病力和EPS合成表型；而将ATG点突变后(只能合成ZurS蛋白)，重组质粒pL6zurGTG可以互补突变体的致病力、EPS合成而不能互补其锌敏感表型，表明从ATG起始或从GTG起始编码的蛋白均有生物学功能，且在功能有交叉也有差异：从ATG起始编码的蛋白ZurL具有锌平衡、EPS合成、致病调控功能，而从GTG起始编码的蛋白ZurS，只有EPS合成、致病调控功能而没有锌平衡功能。为了进一步鉴定ZurL和ZurS蛋白是否存在，我们在NYGB培养条件下对点突变互补菌株和缺失突变体菌株的Zur蛋白进行了Western blotting检测，结果发现在点突变体菌株的细胞提取物均能检测到一条杂交带，而在缺失突变体菌株的细胞提取物中未能检测到杂交带，其结果表明在各自的点突变互补菌株中ZurL和ZurS是存在的，其结果与点突变体的表型检测结果相符。但Western blotting检测野生型菌株Xcc 8004的细胞提取物时，未能检测到两条杂交带。
以上这些结果证明，(1)除了ATG前面的启动子(P1)外，zur基因读码框内GTG上游-108 bp区域(P2)具有启动子活性；(2)从ATG起始编码的蛋白ZurL具有锌平衡、EPS合成、致病调控功能，而从GTG起始编码的蛋白ZurS，只有EPS合成、致病调控功能而没有锌平衡功能。
但在所用的实验条件下，用Western blotting未能检测到Xcc 8004细胞内有两种Zur蛋白。
十字花科;黑腐病菌;锌吸收系统;zur基因;启动子活性
广西大学
硕士
微生物学
何勇强;唐东阶
2008
中文
Q949.748.3
74
2008-11-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）