胃癌FAT10表达与突变p53基因的相关性研究
背景与目的：
FAT10又被称为双泛素(diubiquitin)，属于泛素蛋白家族中的泛素样修饰蛋白(UBLs)，是一个分子量为18 kDa的包含165个氨基酸残基的蛋白质，由两个泛素样结构域融合而成。
临床资料与方法：
一、标本收集
1.病例资料：研究对象为胃癌患者共计62例，其中男性38例，女性24例，年龄21～86岁，平均59.62岁，所有标本均经病理证实。胃癌有淋巴结转移39例，无淋巴结转移23例；有远处转移15例，无远处转移47例；共62例。
2.收集方法：癌旁组织取距肿瘤旁2cm胃组织，正常胃组织取距肿瘤5cm以外胃组织。每个组织均为离体后半小时内取材，剔除坏死出血组织，编号标记并记录临床资料，
3.胃癌TNM分期按1997年国际抗癌联盟(UICC)公布的PTNM分期。
二、主要实验试剂及溶液配制
1.兔抗人FAT10多克隆抗体购自上海吉泰生物科技有限公司。
2.兔抗人p53单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
3.生物素标记的FAT10二抗与p53鼠抗兔二抗分别购自上海吉泰与武汉博士德。
4.免疫组化染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司
5.DAB显色试裁盒、粘片剂APES购自福州迈新生物技术开发有限公司。
6.RNA快速抽提纯化(Trizol)试剂盒购自Gibco BRL公司。
7.Oligo dT及MMLV购自Promega公司
8.引物制备：上海生工生物工程有限公司合成，经Genebank检索为特异性引物：
三、主要仪器和设备产晶名称生产或经销公司国籍石蜡包埋机 Leica公司德国病理石蜡切片机 Leica公司德国万能显微镜成像系统(Leica DMR) Leica公司德国光学显徽镜照相系统 Olympus 日本GeneAmp 2400 PCR System：
四、检测指标及方法：
1.FAT10、p53蛋白免疫组化(二步法)测定：
免疫组化主要操作步骤如下：
1)10％的福尔马林固定的癌组织、癌旁组织及正常胃组织，石蜡包埋，切片。
2)切片常规脱蜡。
3)过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。
4)抗原修复。
5)滴加正常兔血清封闭液。
6)滴加兔抗人FAT10多克隆抗体及一抗为兔抗人p53单克隆抗体工作液，以PBS溶液代替一抗作为阴性对照片。
7)加50ul生物素标记的FAT10二抗及生物素化p53鼠抗兔二抗。
8)DAB显色。
9)苏木素复染。
10)梯度酒精脱水。
11)光学显微镜下观察判定免疫组化结果。
2.FAT10、p53-mRNART-PCR测定：
1)RNA提取及分析：
(1)RNA提取：采用TRIZOL试剂一步提取法。
(2)RNA分析：
①普通琼脂糖凝胶电泳分析。
②分光光度仪分析。
2)逆转录cDNA的合成及电泳验证逆转录产物cDNA。
cDNA模板进行PCR或保存于-20℃冰箱备用．
3)PCR扩增反应：
PCR扩增体系：
(1)内参照β-actin基因PCR扩增反应条件：
94℃,10′→94℃,60″→59℃30″52℃,45″→72℃,60″→72℃,10′72℃,7′30cyclesPCR扩增产物为295bp。
(2)FAT10基因的PCR扩增反应条件；94℃,10′→94℃,60″→59℃,30″→72℃,60″→72℃,10′30cyclesPCR扩增产物为478bp。
(3)突变p53基因的PCR扩增反应条件：94℃,10′→94℃,60″→52℃,45″→72℃,60″→72℃,10′30cyclesPCR扩增产物为：492bp。
4)产物电泳分析。
五、统计学处理
1.免疫组化实验所得定性数据采用x2检验或分类资料的关联性检验判定两者关系。用Spearman秩相关分析两者之间的关系。
2.RT-PCR条带灰度值结果用均数±标准差(-x±s)表示，样本间均数的比较采用t检验，用Pearson相关分析分析突变p53与FAT10表达的相关性。
3.所有数据采用SPSS12.0统计软件包处理，P<0.05表示差异有显著性；P<0.01表示差异非常显著。
结果：
一、免疫组织化学检测FAT10及p53蛋白在胃癌组织、癌旁组织及正常胃组织中的表达
1.FAT10免疫组织化学染色：
FAT10的表达主要定位于细胞核，阳性物质呈颗粒状。
2.p53免疫组织化学染色：
p53的表达主要定位于胞核，阳性物质呈颗粒状，可弥散到胞浆中。p53在胃癌组织中的表达显著高于相应的癌旁组织及正常胃组织，其阳性率分别为45.16％、14.51％及9.68％，
3.FAT10蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系：
胃癌组织中FAT10的表达主要与胃癌的淋巴转移与否及TNM分期(Ⅲ+Ⅳ/Ⅰ+Ⅱ)密切相关(P均<0.05)。
4.FAT10与p53蛋白在胃癌组织中表达的相关性分析：
p53阳性胃癌中FAT10表达率为82.14％(23/28)，而p53阴性胃癌FAT10表达率仅26.47(9/34)，用双向无序分类资料的关联性检验说明FAT10与p53表达存在一定的相关性。S
二、RT-PCR检测FAT10及突变p53-mRNA在胃癌组织、癌旁组织及正常霄组织中的表达
1.胃癌组织、癌旁组织以及正常胃组织中FAT10-mRNA表达：
胃癌组织、癌旁组织及正常胃组织中FAT10-mRNA条带灰度值分别为0.689±0.023、0.463±0.019及0.451±0.028，采用配对t检验，
2.胃癌组织、癌旁组织以及正常胃组织中突变p53-mRNA表达：
胃癌组织、癌旁组织以及正常胃组织中突变p53-mRNA条带灰度值分别为0.471±0.021、0.398±0.017及0.421±0.019，采用配对t检验，
3.FAT10-mRNA的表达与胃癌临床病理特征的关系：
胃癌组织中FAT10-mRNA的表达主要与胃癌的淋巴转移与否及TNM分期(Ⅲ+Ⅳ/Ⅰ+Ⅱ)密切相关(P均<0.05)。
FAT10-mRNA的表达与胃癌临床病理特征的关系结果与免疫组织化学基本一致。
4.FAT10与p53基因在胃癌组织中表达的相关性分析：
Spearman等级相关分析，胃癌组中FAT10基因表达和突变型p53基因表达存在正相关性。用Pearson相关分析其相关性，说明FAT10与p53基因呈显著正相关。
三、胃癌FAT10蛋白及FAT10-mRNA的表达与生存率的关系：
除4例患者失访外，其余病例均获随访，随访时间48～72个月。对本组患者术后累积生存率进行单因素分析，均经Log-rank生存曲线检验。
根据Log-rank生存曲线检验，FAT10蛋白表达阳性胃癌患者生存时间显著低于表达阴性者，P<0.05。
根据Log-rank生存曲线检验，FAT10-mRNA的表达阳性胃癌患者生存时间显著低于表达阴性者，P<0.05。
经Cox模型多因素分析，结果显示FAT10蛋白及mRNA的表达与肿瘤淋巴结转移、远处转移、临床TNM分期、p53蛋白及p53 mRNA同为影响胃癌预后的独立因素。
结论：
1.胃癌组织FAT10蛋白表达及FAT10-mRNA相对表达量显著高于相应的癌旁组织及正常胃组织。胃癌组织中FAT10蛋白及mRNA的表达主要与胃癌的淋巴转移与否及TNM分期密切相关。而与胃癌患者年龄、性别、肿瘤大小、发生部位、进展程度、分化程度及远处转移无显著相关性。FAT10-mRNA的表达与胃癌临床病理特征的关系结果与免疫组织化学基本一致。
2.胃癌组织中p53蛋白表达及p53-mRNA相对表达量明显高于相应的癌旁组织及正常胃组织，而癌旁组织与正常胃组织两者比较无显著性差异。
3.胃癌组织中FAT10基因的表达与突变p53基因的表达均增强，蛋白水平与基因水平检测的结果一致。两者增高在统计学上均有统计学意义，并呈现明显的正相关。
4.FAT10蛋白及FAT10-mRNA的表达阳性胃癌患者生存时间均显著低于表达阴性者。经Cox模型多因素分析，结果显示FAT10蛋白及mRNA的表达与肿瘤淋巴结转移、远处转移、临床TNM分期、p53蛋白及p53 mRNA同为影响胃癌预后的独立因素。
胃癌;FAT10;突变基因
浙江大学医学部;浙江大学;浙江大学医学院
博士
内科学(消化系病)
厉有名
2008
中文
R735.2
90
2008-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）