人胚胎干细胞的分离、培养及建系
自1998年Thomson和Gearhart两个小组分别报道他们用不同材料，不同方法成功分离建立了具有多方向潜能和永久增殖能力的人胚胎干细胞(ES细胞)系和人胚胎生殖细胞(EG细胞)系(二者统称为人胚胎干细胞系)以来，在美国NIH登记的人类ES细胞系已达78株，但真正能供其他实验室做研究的细胞仅10株。我国仅中山大学、中南大学、北京大学有人胚胎干细胞建系的报道。
人胚胎干细胞被用于研究胚胎早期发育，作为器官移植来源为临床应用提供极大的可能性。人类胚胎干细胞培养依赖饲养细胞，目前大多使用胚胎鼠源成纤维细胞作为饲养细胞，因此，在培养过程中存在异种细胞、蛋白和不明病原微生物污染的可能，这将是胚胎干细胞应用到临床需要克服的障碍之一。我们利用IVF中心已实施助孕技术夫妇捐献的冷冻胚胎及5-9周药物流产胎儿探讨人胚胎干细胞建系方法；并以子宫内膜细胞为饲养层，培养人原始生殖细胞，观察其生长特性及分化能力，以建立一个全部来源于人类细胞的全新的胚胎干细胞系，为将来临床的应用提供安全的保障。
方法：
一、hES细胞系的建立
1.胚胎干细胞的分离与培养
行IVF/ICSI助孕患者自愿捐献的冷冻胚胎，捐赠者知情同意和医院伦理委员会讨论通过后，复苏冷冻的胚胎，用G1.3G2.3序贯培养法培养至囊胚，采用免疫外科法分离内细胞团，将其接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上进行培养，直至干细胞集落出现。用机械法、胶原酶、胰酶法、Dispase法对ES细胞进行传代培养。为了保持hES的稳定性，早期用机械法离散为大约100个hES细胞的小簇，接种到新的饲养层上。
2.人类胚胎干细胞的特性的检测
利用碱性磷酸酶试剂盒NBT/BCIP检测胚胎干细胞的碱性磷酸酶活性。用免疫荧光和共聚焦显微镜检测SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-81、TRA-1-60、OCT-4等胚胎干细胞表面标志。细胞遗传学分析：用秋水仙素处理hES细胞3～4小时，胰蛋白酶消化，用甲醇：冰醋酸(methanol：gla-cial)(3:1)固定，Giemsa染色，分析。
拟胚体的形成和体外分化实验：融合的在胚胎干细胞集落(约106个细胞)用胶原酶消化，用拟胚体培养液(撤除LIF)在细菌培养皿悬浮培养。将形成的拟胚体置于低熔点琼脂中，石蜡包埋，切片，用免疫组化法检测mus-cle-specific actin(MSA)，nestin，pan-cytokeratin。
体内分化实验：培养5天的hES克隆用胶原酶消化，收集hES细胞，用25G针将细胞悬液注入SCID鼠后腿皮下，注射10周后，处死，石蜡包埋，切片，观察。
二、子宫内膜基质细胞作为饲养层培养人胚原始生殖细胞标本
取在沈阳市妇婴医院行子宫切除术患者自愿捐献的子宫内膜及行药物流产患者自愿捐献的受精5～9周流产胎儿，捐献者知情同意，且伦理委员会通过。
1.子宫内膜基质细胞的培养
将子宫内膜组织用D-Hank's液冲洗，剪碎，用0.1％胶原酶IV室温条件下消化，用Pasteur吸管反复抽吸、吹打，加人培养液制成细胞悬液。调整细胞浓度，接种于培养瓶中，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。饲养细胞的制备：丝裂霉素C处理培养子宫内膜基质细胞2.5～3小时后换新鲜培养液待用。
2.原始生殖细胞(PGC)的分离与培养
受精4～9孕周人胚胎，从胚体背侧撕下两旁的生殖嵴和肠系膜，剪碎；用0.25％胰蛋白酶消化，终止消化，用吸管移人预先用明胶包被培养皿内，加DMEM培养液。置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养。以后每1～2天更换培养液，每7～8天用0.1％胶原酶或0.25％胰蛋白酶传代。
3.EG细胞生物学特性的检测
利用碱性磷酸酶试剂盒NBT/BCIP检测胚胎干细胞的碱性磷酸酶活性。用免疫荧光和共聚焦显微镜检测SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-81、TRA-1-60、OCT-4等胚胎干细胞表面标志。细胞遗传学分析：用秋水仙素处理hES细胞3～4小时，胰蛋白酶消化，用甲醇：冰醋酸(3:1)固定，Gi-emsa染色，分析。
拟胚体的形成和体外分化实验：融合的100mm皿(约106个细胞)用胶原酶消化，用拟胚体培养液(撤除LIF)在细菌培养皿悬浮培养。将形成的拟胚体置于低熔点琼脂中，石蜡包埋，切片，用免疫组化法检测muscle-specific actin(MSA)，nestin，pan-cytokeratin。
体内分化实验：取已经连续传5代的2个细胞系，分别制备细胞浓度为1×106/ml的细胞悬液注入裸鼠两侧腹股沟处皮下。观察8周,于第8周末处死小鼠，摘取瘤体，测量大小，并行常规组织病理学检查。
流式细胞分选：酶消化细胞，加PBS-F(98％PBS+2％FBS)离心洗涤细胞；加PBS-F，使细胞浓度成10 cell/ml，根据说明书加入适量PE标记SSEA-4 IgM抗体及同型对照，利用FACSVantage SE上机分选。
结果:
一、hES的分离与培养
1.20个解冻卵裂期胚胎，获得9个囊胚，分出完整的内细胞团共7个，从7个内细胞团培养出2个胚胎干细胞系。这两个细胞系来源的囊胚均为优质囊胚。
2.1-8代用机械法传代；大量的细胞可采用胶原酶或胰酶消化传代。三种方法比较，机械法费时、费力；克隆大小不均；胶原酶温和，传代后细胞活性保存较好。胰酶作用强，作用时间短，细胞分散好，但较难掌控。
3.两个系细胞Ⅰ、Ⅲ分别培养传代20代、18代。未分化的hES细胞克隆融合、扁平或圆形，细胞界限清楚；集落内的细胞核大、核仁清楚，胞核与胞浆的比率高，可见1～3个核仁。
4.两个细胞系核型均正常，体外传代4个月后核型保持稳定。有正常的46，XX核型。
5.本研究所培养的2个系细胞表达碱性磷酸酶、SSEA-3阳性、SSEA-4阳性、TRA-1-81阳性、TRA-1-60阳性、OCT-4阳性，而SSEA-1阴性。
6.hES细胞在体外培养4天部分开始囊性变，培养7～8天全部分化为囊实性结构，成为成熟拟胚体。石蜡切片免疫组化显示有三个胚层标记物表达，如muscle-specific actin(MSA)，nestin，pan-cytokeratin。
7.将细胞注射人SCID-biege鼠皮下，形成肿瘤，病理切片为成熟畸胎瘤。
二、子宫内膜基质细胞作为饲养层培养人胚原始生殖细胞：
1.人子宫内膜基质细胞生长情况基质细胞呈现中间稍宽，两端尖的形态，似梭形，亦有细胞呈多角形，细胞核呈卵圆形，长期连续培养后，梭形细胞延伸成长梭形，相互平行排列成束。丝裂霉素C处理后可持续生长4周。
2.从肠系膜分离得到的PGC多，一般在体外培养7～10天可以出现数个大的多层细胞集落，形似鸟巢。人EG细胞的体积较大，核质比高，核内有2个以上的核仁，与hES细胞相似。有一个细胞系在人子宫内膜成纤维细胞饲养层上传，4个半月(18代)，保持未分化状态。
3.PGC表达胚胎干细胞的多种标志，如碱性磷酸酶阳性、SSEA-1阳性、SSEA-3阳性、SSEA-4阳性、TRA-1-81阳性、TRA-1-60阳性、OCT-4阳性，细胞保持正常的染色体核型46，XX。
4.将EG细胞注射入裸鼠体内，形成组织学检查包括皮脂腺、脂肪、腺体及腺上皮、鳞状上皮的成熟畸胎瘤。
5.细胞无饲养层悬浮培养7天，部分EB开始膨胀，成为囊状拟胚体。将拟胚体切片，免疫组化结果显示MSA、Nestin、Pan-cytokeratin呈阳性。
6.用SSEA-4直标抗体对细胞进行流式细胞鉴定，发现的SSEA-4阳性细胞占15。45％。
结论：
1.本研究建立的两个细胞系均为人类胚胎干细胞系，具有人胚胎干细胞的所有特征。
2.在IVF周期中剩余的冷冻胚胎可以作为人胚胎干细胞的来源。
3.人子宫内膜基质细胞可以作为饲养细胞在体外培养人胚原始生殖细胞。
4.在子宫内膜基质细胞上生长的人胚原始生殖细胞具有人胚胎干细胞的所有特征。
胚胎干细胞;胚胎生殖细胞;细胞分离;细胞培养
中国医科大学
博士
遗传学
孙开来
2006
中文
R321
90
2008-09-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）