三七消减文库构建和皂甙合成关键酶基因克隆及表达
三七(Panax notoginseng(Burk．)F．H．Chen)为五加科人参属植物，是云南的道地药材，有“南方人参”之称。达玛烷型四环三萜皂甙是三七的主要活性物质，在血液系统、心脑血管系统、神经系统、免疫系统、物质代谢以及抗炎、抗衰老、抗肿瘤等方面均有较好的活性。三七皂甙含量与三七的生长年限和生长部位有关。根部是重要药用器官，且3年生根的皂甙含量高于1年生根。推测三七皂甙含量的时间性差异很可能和皂甙生物合成相关基因差异表达调控有关。为了解三七达玛烷型皂甙合成的分子机理，必须首先克隆到相关的差异表达基因并进行深入的研究。
该研究利用抑制消减杂交技术构建了三七1年生根和3年生根cDNA的正反向抑制减消文库。结果表明：正向消减文库包括2,000个cDNA克隆，反向消减文库包括500个cDNA克隆，2个库的重组率都在95％以上，cDNA片段的长度分布在200～900 bp左右，平均长度约500 bp左右。消减效率检测结果表明：消减杂交将18S rRNAL对照基因减弱了32,000倍。以上结果表明：所构建的cDNA文库能够满足下一步实验的要求。
对所得到的正反向消减文库进行斑点杂交，分别从文库中挑选插入片段在500 bp左右的质粒200个，与1年生和3年生DIG标记的SSH-探针分别进行杂交，筛选到110个来自只在三七3年生根中表达或表达量增加的基因，80个来自只在三七1年生根中表达或表达量增加的基因。为进一步确定差异表达基因，我们从斑点杂交的阳性克隆中挑选了6个差异基因进行半定量RT—PCR验证，结果表明：在3年生根中发动蛋白鸟苷三磷酸酶效应子，γ-谷氨酰水解酶，多铜氧化酶Ⅰ型家族蛋白，IspG蛋白，还原型辅酶I氧化酶家族蛋白基因表达上调，而S腺苷高半胱氨酸水解酶基因表达下调，提示抑制消减杂交筛选到的大多基因如果在3年生根中高表达，则在1年生根中不表达或差异表达。6个差异表达基因同源比对功能分析结果表明：IspG蛋白是皂甙生物合成途径中关键酶，其它5个基因可能与皂甙的合成有直接或间接关系。 IspG蛋白生物信息学分析结果表明.IspG蛋白的EST由524个核苷酸组成，编码146个氨基酸残基，分子量为15.636 KDa。有1个与转录子有关的结构域，功能位点有N-豆蔻酰化位点，N-糖基化位点，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。其同源性在植物中达90％以上，在微生物中达50％。亚细胞定位于细胞质。
对91个EST克隆测序和序列组装分析结果表明：有4个重叠群(Contig)和83个单拷贝EST(Singlet)，代表了共计87个独立基因(Unigene)，其中23个cDNA含有poly A序列，占整个克隆数的26.4％。功能分类结果表明：已知功能的唯一序列共58个，占66.6％，未知功能唯一序列29个，占33.3％。对已知功能基因分类，得到11类，其中大多基因与代谢途径和分泌途径有关。
对37个氨基酸序列可通读的EST进行生物信息学分析，其中跨膜结构和信号肽分析结果表明：3个克隆有跨膜结构，8个克隆有信号肽或是信号锚定蛋白。功能位点分析结果表明：大多数基因与胞外分泌，调节细胞凋亡和细胞周期，信号传导有关。功能结构域分析结果表明：除10个克隆没有预测到功能结构域外，其它结构域与信号传导，转录调控，电子传递等有关。亚细胞定位大多数位于细胞质中。
鲨烯环氧酶是皂甙生物合成途径过程中的1个重要的限速酶。根据人参鲨烯环氧酶cDNA序列合成引物，我们从三七根中扩增到三七鲨烯环氧酶全长cDNA。该基因开放阅读框含有1，622个核苷酸，编码537个氨基酸残基，其分子量为59.139 KDa，等电点为8.81(GenBank登录号DQ386734)。同源性分析结果表明，三七鲨烯环氧酶与其它生物鲨烯环氧酶均具有不同程度的同源性。与人参鲨烯环氧酶同源性达到9896，进化树的分析为同一祖先。生物信息学分析三七鲨烯环氧酶基因含有FAD功能区，以Rossmann折叠的NAD(P)-结合区，FAD/NAD(P)-结合区，疏水性，跨膜结构，这些结构和基序说明三七鲨烯环氧酶是一个膜蛋白，可从胞质溶胶中分泌出来。三七鲨烯环氧酶中含有WD domain，G-beta repeat保守结构域，人参中却没有该结构域。二者的亚细胞定位于质体中。人参和三七的编码基因中的密码子偏爱性并不强，仅个别密码子存在偏爱性。
荧光定量PCR实验结果证明，三七鲨烯环氧酶在三七不同组织中存在差异表达，在根中的表达水平高于茎和叶，而茎又高于叶，3年生根的表达又高于1年生根的表达。这些结果说明，三七鲨烯环氧酶基因的表达可能是组织特异性的。对该基因表达的研究可为阐明皂甙生物合成途径和其药理学活性奠定基础。
三七;三七皂甙;抑制消减文库;斑点杂交;序列分析基因预测;基因克隆;鲨烯环氧酶;基因表达
四川大学
博士
遗传学
张义正
2006
中文
R284.1;Q785
177
2008-06-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）