短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因启动子的功能研究
短小芽孢杆菌UN-31-C-42是一株产生具有脱毛功能的碱性蛋白酶的菌株。该菌株的碱性蛋白酶基因编码区已被克隆，本研究通过TAIL--PCR(Thermalasymmetric interlaced PCR)扩增得到碱性蛋白酶基因编码区上游的启动子片段Papr，经测序、序列拼接及比对分析等对Papr进行了鉴定。该启动子片段长797bp，在片段的5’端存在一个开放阅读框，可能为磷酸甘油酸变位酶基因的部分编码区，故碱性蛋白酶基因启动子的长度为378 bp。通过对启动子序列的分析，推测出了该启动子的保守序列及转录起始位点。对启动子的顺序缺失研究证实基因起始密码子上游160bp的DNA片段包含完整的启动功能片段。
根据Papr序列设计引物，从短小芽孢杆菌UN-31-C-42基因组中扩增获得了包含启动子、信号肽、前肽、成熟肽及终止子的完整的碱性蛋白酶基因片段WAp。将WAp插入大肠杆菌一芽孢杆菌穿梭质粒载体pSUGV4中，构建了碱性蛋白酶基因表达质粒pSUBpWAp。将pSUBpWAp分别转入大肠杆菌JM109、枯草芽孢杆菌WB600以及短小芽孢杆菌UN-31-C-42中进行表达。包含了质粒pSUBpWAp的大肠杆菌JM109细胞内外均检测不到碱性蛋白酶活性。在枯草芽孢杆菌WB600中的表达则可在胞外检测到碱性蛋白酶活性，证明启动子Papr可在枯草芽孢杆菌中启动碱性蛋白酶基因的表达，产生的碱性蛋白酶活性最高达到466.5U/ml，与包含Bp53启动子的碱性蛋白酶基因表达质粒pSUBpAp比较，酶活提高2倍。pSUBpWAp在短小芽孢杆菌UN-31-C-42中也能表达产生碱性蛋白酶活性，但宿主菌的蛋白酶产量并未提高。利用细菌的16s rDNA通用引物从短小芽孢杆菌UN-31-C-42基因组中扩增到16s rDNA片段，将该片段插入载体pMD18-T中，构建了重组质粒pMD16s。从载体pSUGV4中扩增到卡那霉素抗性基因片段，与碱性蛋白酶基因一同插入质粒pMD16s的16s rDNA片段中，构建整合型质粒。拟将该质粒整合至短小芽孢杆菌基因组，提高其蛋白酶产量。
碱性蛋白酶基因;启动子;短小芽孢杆菌;枯草芽孢杆菌;基因编码
四川大学
硕士
遗传学
王海燕
2006
中文
Q556.9;Q75
83
2008-06-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）