用于基因表达谱研究的三种不同基因芯片平台的比较
基因表达谱芯片是一种高通量的研究mRNA表达水平的工具。目前，表达谱芯片已经应用到多个领域，如功能基因组学，毒理学等。基因表达谱芯片主要可以分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片两大类。原位合成的寡核苷酸芯片便于商品化生产，但技术要求很高；而cDNA芯片相对比较容易制备。在本研究种我们比较了三种表达谱芯片，Affymetrix芯片和 Agilent芯片，以及我们实验室自己制备的一种cDNA芯片。Affymetrix芯片是通过光蚀刻原位合成的25mer寡核苷酸芯片，Agilent是使用Ink-jet技术原位合成的60mer的寡核苷酸芯片，cDNA芯片是把500-1kb长的PCR产物片段直接点到玻璃片上制成的。
实验中使用了两对手术切除的肿瘤标本以及相应的癌旁组织 (一对胃癌，一对肝癌)，芯片分别为Affymetirx HG-U133A 芯片，AgilentHuman 1A Microarray(V2)和我们自制的人14K芯片。首先通过生物信息学分析，找出了5934个在三个平台都有的基因。杂交 Affymetrix 芯片和 Agilent 芯片需要对 RNA 样品用体外转录进行线性放大，Affymetrix 需要12.5μg的cRNA，Agilent 芯片需要约4μg的cRNA，而cDNA芯片只需要约30μg的总RNA。芯片杂交后，就灵敏度来看，Affymetrix 芯片的信号相对较弱，在5934个共同基因中，有表达的基因约为50-60％，而Agilent和cDNA芯片都在80％以上。通过RT-qPCR的验证，有不少 Affymetrix芯片没有检测到的基因实际是有一定量的表达的。而计算不同平台产生的信号值的Pearson相关系数和Spearman相关系数，结果为0.45-0.55(Affymetrix和自制芯片)，0.37-0.52(Agilent和自制芯片)，0.63-0.69 (Affymetrix和Agilent 芯片)。如果去除各个平台中一些不可靠的数据，可以使相关系数提高约 0.1。取Cut-off值为 2，三个平台总共挑选出273个上、下调基因，其中约20％的基因可以从所有三个平台中挑选出来，40％-70％的基因可以从两个平台中选出。使用 RT-qPCR 验证挑选出的上下调基因，两对标本各选了 40个基因，结果表明，所有结果的趋势基本一致(即从一个平台选出的上调基因，在另一个平台不会是下调，但可能会是没有改变，反之亦然)，Affymetrix 芯片的假阴性率相对较高，Affymetrix 芯片结果显示为Absent的基因，在qPCR验证中，约有80％的基因有表达。cDNA芯片的假阳性率相对较高，但同时从该种芯片中挑选出了一些不能从其它平台发现的上下调基因，约占验证基因数的5-10％。以上结果表明，各平台相互之间的结果有一定的差异，但仍具有一定的可比性。原位合成的寡核苷酸芯片的重复性和特异性相对较好，而cDNA芯片的灵敏度相对较高，可能更适合粗筛和检测表达量较低的基因。
基因表达谱;寡核苷酸芯片;基因芯片;功能基因组学
中国科学院上海生命科学研究院
博士后
肖华胜;张清华
2006
中文
Q78
39
2008-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）