家蝇低分子量壳聚糖的抗菌活性及在家蝇免疫系统中的作用
家蝇是一种重要的资源昆虫，长期生活在各种恶劣的自然环境中，具有优良的免疫防御系统。抗菌物质在免疫防御系统中具有重要的作用，对家蝇抗菌物质及其在免疫系统中作用的研究具有重要的理论意义和应用价值。
为研究家蝇免疫防御系统的抗菌物质，本研究采用酸法提取家蝇干蝇蛆抗菌物质进行抗菌活性的研究。结果表明提取的物质能够显著抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，性质和结构分析表明该物质为非蛋白类的抗菌物质，具有家蝇甲壳素/壳聚糖的一些典型特征，推测为家蝇低分子量壳聚糖。
为研究家蝇低分子量壳聚糖生成的分子生物学基础，本研究采用同源克隆并结合cDNA末端快速扩增技术克隆了家蝇几丁质酶cDNA全序列和甲壳素脱乙酰酶cDNA片段，并对几丁质酶cDNA序列进行多序列比对、结构域分析、高级结构分析、进化树构建等生物信息学分析。结果表明家蝇几丁质酶cDNA序列全长1573 bp(GenBank登录号：DQ868537)，包含一个1401 bp(84～1484bp)的开放阅读框，编码466个氨基酸。成熟的几丁质酶蛋白质分子由444个氨基酸组成，分子量为48507.4 Da，理论等电点pI=6.66。家蝇几丁质酶氨基酸序列的1～22位为信号肽，141～149位点为几丁质酶活性中心位点，423～426位点为N-糖基化位点，412～466位点为几丁质结合位点CBD。家蝇几丁质酶催化区域的高级结构特征是(β/α)<,8>桶状折叠，内部由8个平行的β-链组成，外壳由8个α-螺旋构成。家蝇几丁质酶和果蝇及舌蝇几丁质酶相似度最高，位于进化树的同一个分支上。甲壳素脱乙酰酶克隆得到了长度为822 bp的片段。
为获得纯的家蝇低分子量壳聚糖，本研究以家蝇幼虫为材料，研究了家蝇甲壳素提取和低分子量壳聚糖的制备工艺及动力学。家蝇甲壳素提取的优化工艺为：培养4 d的家蝇幼虫匀浆，离心得到蛆皮；蛆皮用5％NaOH在95℃作用6 h脱蛋白；用0.3％高锰酸钾浸泡1 h脱色，接着用1％的草酸浸泡1 h去除残余高锰酸钾；用2 mol/L的盐酸室温浸泡1 h除灰分；干燥即得到白色片状家蝇甲壳素。家蝇甲壳素的收率达到干重10.6％，残余氮含量达到6.33％，残余灰分含量为0.156％。壳聚糖制备的优化工艺为：按照1：50的比例将家蝇甲壳素悬浮在45％的NaOH溶液中，70℃连续反应12 h，脱乙酰度可达到86％；90℃连续反应12 h，脱乙酰度可达到90％。甲壳素脱乙酰反应的动力学方程为：家蝇低分子量壳聚糖的制备采用氧化降解法。降解的优化工艺为：壳聚糖溶解在1％的乙酸中，终浓度为1％，加入过氧化氢使终浓度为3％进行反应，反应温度为50～60℃，在不同的反应时间终止反应即可得到不同分子量的壳聚糖。
为研究家蝇低分子量壳聚糖的抗菌活性及机理，本研究利用降解得到的10个不同分子量的家蝇壳聚糖，对7种细菌做体外抗菌实验，研究不同分子量壳聚糖的抗菌活性及影响因子。并通过测定细菌细胞透性变化和透射电镜观察细胞的完整性，研究壳聚糖的抗菌机理。结果显示不同分子量的家蝇壳聚糖对测试的3种革兰氏阳性菌和4种革兰氏阴性菌都有显著的抗菌活性，抗菌效果受到壳聚糖的分子量、溶液pH。、菌株类型、溶液金属离子浓度、壳聚糖的浓度等因素的显著影响。随着粘均分子量的增大，壳聚糖的抗菌活性显著降低，在测试的10个不同分子量的壳聚糖中，粘均分子量为15.kD～76 kD的低分子量壳聚糖抗菌活性最强。pH也是壳聚糖抗菌活性的极显著影响因素，随着pH的降低，壳聚糖的抗菌活性显著增强。这说明壳聚糖分子中有效-NH<,3><'+>的数量是其抗菌活性的关键因素之一。统计结果还显示壳聚糖抗菌活性的高低是由分子量、菌株和pH共同决定的，即壳聚糖对特定菌株的抗菌效果只有在特定的pH和特定的分子量下才最明显。金属离子会显著降低壳聚糖的抗菌活性，特别是Ca<'2+>和Mg<'2+>。推测壳聚糖和环境中金属离子结合使其不能被细菌所利用也是其抗菌原因之一。壳聚糖的最小抗菌浓度随分子量和菌株的不同而不同，活性最高的15 kD壳聚糖对7种细菌的最小抗菌浓度为0.03％～0.06％。不同来源壳聚糖的抗菌活性基本一致，但在有金属离子存在的条件下，家蝇壳聚糖的抗菌活性明显高于蟹壳壳聚糖。壳聚糖会使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞壁和细胞膜的透性增加，造成细胞胞内物质的外流，这可能也是壳聚糖的抗菌机理之一。
电镜观察显示低分子量的15 kD壳聚糖能够造成细菌细胞壁和细胞膜的破裂，高分子量的251 kD壳聚糖能够结合在细胞壁外表面，从而造成细胞死亡，说明不同分子量的壳聚糖抗菌机理不同。家蝇壳聚糖还具有抗真菌活性和诱导植物抗病性的能力。壳聚糖能有效抑制真菌的生长，培养4 d后，0.5％的壳聚糖对苹果轮纹病菌和立枯丝核菌的抑制率达到90％以上，对花生尾孢菌的抑制率达到80％以上，对可可刺盘孢的抑制率达到70％以上，对黑曲霉和黄曲霉的抑制率在50％～60％，对黑根霉的生长没有抑制。溶液pH值会影响到壳聚糖的抗真菌活性，pH从5.5降低到4.5，生长抑制率提高了5～10％。壳聚糖的浓度对抗真菌活性有显著影响，抗真菌效果随着浓度的增高而增加。用不同分子量的壳聚糖处理黄瓜叶片，均能使叶片的POD、PPO和PAL酶活性提高。在作用后的第6 d PPO的活性达到峰值，而POD和PAL的活性在作用后的第8 d达到峰值。分子量为8 kD和15 kD的壳聚糖处理黄瓜后，能诱导新的POD同工酶谱带产生。壳聚糖浸种并喷施土壤能有效防治黄瓜立枯病，出苗率提高了30％，相对防效达到50％以上。
家蝇;壳聚糖;抗菌活性;几丁质酶cDNA;免疫系统
南开大学
博士
遗传学
杜荣骞
2006
中文
Q969.453.8
163
2007-12-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）