神经干细胞共移植体体外构建的实验研究
目的：通过实验筛选合适的细胞外基质，利用脑微血管内皮细胞(vascular endothelial cells VECs)、细胞外基质与神经干神胞(neural stem cells NSCs)共同构建神经干细胞共移植体，以提高移植神经干细胞存活和定向分化为神经元，减少其凋亡。
方法：实验分为两个部分。一是利用无血清培养和细胞克隆培养技术，从新生Wistar大鼠(1-3d)海马分离NSCs，进行体外扩增培养、传代，采用免疫组织化学法和荧光法做nestin染色鉴定；利用M199培养基，从新生1-7d Wistar大鼠大脑中分离脑微血管内皮细胞，进行体外扩增培养，采用免疫细胞化学方法鉴定；选用不同的细胞外基质包括多聚赖氨酸(poly-L-Lysine)，层粘连蛋白(LN)、Matrigel与两种细胞进行贴壁共培养，镜下观察与三组细胞外基质共培养NSCs的存活、增殖、分化情况；采用免疫细胞化学方法观察不同时间点(3d、7d、14d)NSCs定向分化为神经元、星形胶质细胞情况及NSCs增殖、凋亡情况。二是NSCs共移植体构建及检测：将传代的脑微血管内皮细胞用0.25％胰酶消化20min后，以3×10<'7>L<'-1>的密度接种在培养瓶中，12h贴壁后吸出脑微血管内皮细胞培养液，涂以一层细胞外基质后，接种经0.125％胰酶消化20 min后吹打成单细胞NSCs悬液，密度为6×10<'8>L<'-1>，加入NSCs完全培养液。培养3-6h镜下观察NSCs完全贴壁后，吸出培养液，再涂以一薄层细胞外基质，再接种以上相同密度的脑微血管内皮细胞，加入NSCs完全培养液，共培养12-24h，形成分层结构(VECs-细胞外基质-NSCs-细胞外基质-VECs)，经适力吹打形成 NSCs共移植体，利用免疫荧光的方法，以Ⅷ因子标记物标记脑微血管内皮细胞，用 nestin标记Nscs，检测共移植体。将不同基质构建的共移植体接种于放有盖玻片的六孔板中，加入神经干细胞培养液，在3d、7d、14d镜下观察共移植体的生长情况。
结果：
1、NSCs和VEcs形态学观察及鉴定：原代分离的单NSC 4d增生为神经细胞球，传代后，经nestin免疫荧光染色，细胞球呈阳性；原代培养脑微血管内皮细胞6-8d长满瓶壁，细胞呈多角形或扁平梭形，核卵圆形，Ⅷ：因子相关抗原阳性。
2、三种细胞外基质对NSCs分化影响：3d时MAP<'2>免疫组化阳细胞数，由层粘连蛋白参与的共培养明显高于由Matrigel、多聚赖氨酸参与的共培养(P<0.05)；7d时差距更加明显(P<0.01)；14d时LN组高于Matrigel组差距不时显，且两者明显高于多聚赖氨酸组(P<0.01)。3d时GFAP免疫组化阳细胞数，由层粘连蛋白参与的共培养高于由 Matrigel、多聚赖氨酸参与的共培养(P<0.05)，7d时三组差距不明显，14d时多聚赖氨酸组和Matrigel组差距不明显，但两者明显高于LN组(P<0.05)。3d、7d、14d时，GFAP+MAP<'2>免疫组化阳细胞数，由层粘连蛋白参与的共培养明显高于由Matligel、多聚赖氨酸参与的共培养(P<0.01)。
3、LN的细胞粘附性较好，两种细胞参与共建细胞数较高，共移植体平均细胞数8-15个，平均共移体直径28μm，较合适体内移植。
4、共培养中神经干细胞的增殖和凋亡的检测：随着天数的增加，神经干细胞数也随之增加，但3d时，LN组和Matrigel组Brdu阳性细胞数明显高于多聚赖氨酸组(P<0.05)，7d时Brdu阳性细胞数各组均增多，但LN组和Matrigel组。Brdu阳性细胞数明显高于多聚赖氨酸组(P<0.01)，14d时各组细胞增殖明显，LN组和Matrigel组Brdu阳性细胞数明显高于多聚赖氨酸组(P<0.01)；在三个时间点(3d、7d、14d)可见LN组和Matrigel组Caspase/Brdu双阳性细胞数明显低于多聚赖氨酸组。
5、共移植体活细胞镜下所见及免疫荧光结果：通过分层贴壁共培养和适力吹打可以形成LN、VECs和NSCs特征性结构。这种结构以VECs和NSCs紧密相贴或VECs半包NSCs为等征。镜下可见共移植体细胞团不规则，NSCs被脑微血管内皮细胞包绕或相互连贴，脑微血管内皮细胞细胞核大，胞体不规则，明显大于NSCs，NSCs折光性强。在200倍视野下，随机选取100个共移植体进行细胞计数，可见平均细胞数为8-15个，其中脑微血管内皮细胞数平均2.8个。免疫荧光可见红色Ⅷ：因子阳性VECs包被绿色nestin阳性NSCs，或相互粘贴。
结论：
1、层粘连蛋白具有良好的细胞粘附性，可使神经干细胞与脑微血管内皮细胞间很好的粘附，可形成大小适中的神经干细胞共移植体。
2、层粘连蛋白较多聚赖氨酸和Matrigel有更好的促进神经干细胞分化的能力，并诱导其定向分化为神经元；从而使神经干细胞分化为胶质细胞数较少，有利于共移植体植入体内发挥神经替代作用。
3、层粘连蛋白能提高神经干细胞存活，促进神经干细胞的增殖和内皮细胞增殖，并通过内皮细胞间接地促进神经干细胞增殖。
4、层粘连蛋白较多聚赖氨酸和Matrigel有更好地促进神经干细胞分化时轴突生长的作用，并且可促进神经干细胞的迁移。
5、层粘连蛋白是构建神经干细胞共移植体较理想的细胞外基质，以脑微血管内皮细胞为支持细胞，以层粘连蛋白为细胞外基质，经分层立体共培养(VECs-LN-NSCs-LN-VECs)，适力吹打可以成功构建适合体内移植的神经干细胞共移植体。
神经干细胞;共移植体;脑微血管内皮细胞;细胞外基质
佳木斯大学
硕士
神经病学
朱晓峰;黄作义
2007
中文
R741
59
2007-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）