谷子在干旱逆境中差异表达基因的分离与表达谱分析
谷子(Setaria italica(L．)Beauv)起源于我国的黄河流域，在中国种植已有7000年的历史，是世界上栽培历史最悠久的作物之一。谷子耐旱能力强、水分利用效率高，适于在我国干旱少雨的地区播种。目前有关谷子抗旱性分子机制和从谷子中发掘抗旱基因的研究几乎是空白。为了发掘谷子中的抗旱基因，我们首次利用抑制性差减杂交法构建了谷子干旱诱导表达差减文库和干旱抑制表达差减文库，并采用cDNA microarray技术分析了差减文库的表达谱，筛选获得了很多有意义的差异表达片段。文章并报道克隆到一个在谷子根中被干旱逆境特异诱导表达的基因12氧代植二烯酸还原酶(SiOPRl)，并对该基因的表达特性进行了详细的分析。
实验首先从鲁7060、羊角黄、豫谷5号、Jun 24和Mar51五个谷子品种中通过苗期快速鉴定选出一个较抗旱品种Mar 51。以品种MaLr 51为研究材料，应用20％的PEG6000处理谷子幼苗根系模拟自然干旱逆境，利用抑制性差减杂交法同时构建了干旱诱导表达差减文库(正库)和抑制表达差减文库(反库)。正库共挑菌2112个，反库共挑菌1372个，并全部送去测序。序列经过去载体和去接头后，拼接在一起，最后正库共获得414个Contigs和745个Singletons，合计1159个UniESTs。反库共获得136个Contigs和1804个Singletons，合计940个UniESTs。同时出现在正库和反库中的序列数为150个，合并正库和反库在一起共获得1949个谷子LlniESTs。测序出现低的冗余度表明构建差减文库的均一化水平和差减效率都很高。将1949个谷子UniESTs按照MIPS进行功能分类，共包含21个大类，占有比例最高的一类是代谢相关基因，其次是转录相关的基因，再次是参与蛋白质合成与降解、参与细胞命运、细胞信号转导和能量代谢等生物学过程的基因。
为了验证差减文库和筛除假阳性克隆，我们将获得的1949个UniESTs点制了cDNA芯片，利用cDNA micromTaV技术对差减文库进行了鉴定和表达谱分析。结果表明，受干旱逆境诱导表达的ESTs在根中共获得93个，在地上部中共获得52个。受干旱逆境抑制表达的ESTs在根和地上部中分别获得10和27个。在根和地上部中被干旱逆境共同诱导表达的ESTs仅有5个，共同抑制表达的没有出现。采用Northem blot杂交实验进一步验证了cDNA microarray的结果，在挑选的10个表达模式不同的ESTs中，Northem blot杂交结果都很好地与cDNA microarray实验的结果相互印证，有力地说明了cDNA microarray实验结果的可靠性。
谷子幼苗在干旱逆境下的基因表达谱分析表明，在根和地上部中分别由不同类别的基因参与响应干旱逆境，表现出不同的分子机制。在干旱逆境下谷子中很多基因是被抑制表达的，因此我们提出负调控在谷子适应干旱逆境反应中起着重要的作用。一个很有趣的结果是，在谷子根系早期诱导表达的基因多数是参与糖代谢途径(包括糖酵解、三羧酸循环、和糖异生途径)的酶，说明谷子根系在最早期的适应性反应是基本能量代谢被激活。此外，发现蛋白质降解和修复在谷子干旱适应性分子机制中也具有很重要的调控作用。
为了分析ABA和茉莉酸甲酯(MeJA)两种植物激素在谷子适应干旱逆境中的作用，采用同样的芯片，分析了ABA和MeJA处理对谷子基因表达的影响。结果显示，被ABA诱导表达的ESTs在根和地上部中分别有72和135个，被ABA抑制表达的ESTs在根和地上部中分别有123和18个。同时在根和地上部中被ABA诱导表达的ESTs仅有2个，抑制表达的仅有6个。在MeJA处理中，在根和地上部中被诱导表达的ESTs分别有78和10个，在根和地上部中被抑制表达的ESTs分别有17和122个。同时在根和地上部中被MeJA诱导表达的EST只有1个，抑制表达的也是1个。聚类分析PEG、ABA和MeJA作用下的基因表达谱发现，PEG处理下的基因表达模式在根中与MeJA更为接近，在地上部中与ABA更为接近。分别比较PEG与ABA、PEG与MeJA之间基因表达的重叠图发现，重叠基因的数目并不是太多，因此认为在谷子适应干旱逆境的调控途径中，除ABA和MeJA调控途径之外还包括其它的途径。
从干旱诱导表达EST中，挑选出两个受PEG强烈诱导的ESL，发现编码同一个基因的产物12氧代植二烯酸还原酶。根据这两个EST片段的已知序列，利用RACE技术首次从谷子中克隆获得12氧代植二烯酸还原酶基因的全长cDNA序列，命名为SiOPRl。SiOPRl基因全长共1360bp，编码374aa，预测分子量为41.9kDa，等电点为5.14。在氨基酸水平上，SiOPRl基因编码的蛋白质在禾谷类作物的不同物种之间保守性很高。不同逆境因子(包括PEG、ABA、NaCI和MeJA)处理的表达谱分析结果表明，SiOPRl基因只被干旱逆境处理特异地诱导表达，而且诱导部位只限制在根中，在地上部不受诱导。ABA、NaCl和MeJA处理对SiOPRl基因的表达都没有影响。不同组织部位的Northem杂交结果显示，SiOPR基因的表达水平都很低，检测没有杂交信号。SiOPR基因在谷子响应干旱逆境中的表达模式预示着该基因在谷子中是受干旱逆境诱导表达的，而在正常生长状态下的表达水平很低，推测它可能在谷子的抗旱适应性防御反应中起着重要的作用。
谷子;干旱诱导表达;抗旱基因;cDNA芯片;12氧代植二烯酸还原酶
中国农业大学
博士
遗传学
王国英
2006
中文
S515.01
122
2007-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）