大肠杆菌中5-氨基酮戊酸合酶（ALAS）系列新型融合表达载体的构建、表达及纯化
5-氨基酮戊酸合酶(5-Aminolevulinic acid，ALAS)存在于所有的生物体内，是C4途径中血红素合成代谢的限速酶，催化琥珀酰辅酶A和甘氨酸缩合成ALA，CoA和CO<,2>。ALA是合成卟啉、血红素、叶绿素、维生素B12等四吡咯化合物的代谢中间体，在农业生产中具有广泛的应用，不仅可作为除草剂、杀虫剂，还可提高植物的抗盐、抗冷冻能力，这对于缓解生态环境恶化，提高农业生产水平具有重要的现实意义。此外，5-氨基酮戊酸也被广泛用于肿瘤的症断及癌症的治疗方面。目前，由于不易获得大量天然ALAS而阻碍对其结构与功能的研究。本实验为了获得天然蛋白，构建了三种新型ALAS融合表达载体(pET-HMA，pET-HGA，pET-HDA)。把含有外源片段的三种载体分别转入BL21中进行诱导表达，经镍柱一步纯化可获得高纯度的ALAS重组蛋白。本实验主要获得如下结果：
1．根据已公布的heml基因的全序列，以酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)基因组为模板，去除N端导肽序列的核苷酸序列，以编码Asn63为第一个氨基酸残基，上游引物编码的起始氨基酸为Met，设计并合成引物，采用PCR扩增出一个大小约为1.4-1.5 kb的特异DNA片段，进一步测序表明同已公布的酿酒酵母heml基因片段的序列完全相同。
2．成功的构建了AIAS三种新型融合表达载体：pET-HMA，pET-HGA和pET-HDA三种融合表达的蛋白在N端都具有六个组氨酸和三种最常用的具有增加可溶性表达的标签(GST，MBP，DHFR)，并且融合蛋白中具有TEV蛋白酶的切割位点。
3．pET-HMA，pET-HGA和pET-HDA三种融合表达载体转入BL21进行诱导表达后，通过SDS-PAGE分析表明三种融合的蛋白：MBP/ALAS，GST/ALAS，DHFR/ALAS都为可溶性表达且表达量有显著的提高。MBP/ALAS未能获得完整的融合蛋白，在MBP与ALAS之间在胞内发生了断裂，推测可能的原因是MBP与ALAS连接的肽链过长暴露在融合蛋白外被胞内蛋白酶水解。本实验获得了GST/ALAS和DHFR/ALAS融合表达的蛋白，分子量都为70kD。表明担体蛋白GST和DHFR能促进ALAS正确折叠和增加其可溶性表达。
4．带有His-Tag的融合蛋白GST/ALAS和DHFR/ALAS经镍柱一步纯化后，SDS-PAGE分析表明纯化都为均一的一条带。表明利用His-Tag筛选和纯化目的蛋白是一种快速而有效的方法综上所述，本文已成功地从酿酒酵母基因组克隆出编码成熟5-氨基酮戊酸合酶的基因片段，并构建了三种高效原核融合表达载体：pET-HMA，pET-HGA和pET-HAD。获得了ALAS在大肠杆菌中的高效重组表达重组蛋白，并纯化至均一，为ALAS晶体结构解析及酶催化机理和功能的研究提供了基础。同时三种高效原核融合表达载体：pET-HMA，pET-HGA和pET-HAD为蛋白质在原核系统的高效表达提供了平台。
重组蛋白;5-氨基酮戊酸合酶;融合表达;麦芽糖结合蛋白;大肠杆菌
安徽农业大学
硕士
生物物理学
范军
2007
中文
Q785
42
2007-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）