Bacillus subtilis自然感受态建成相关蛋白质研究
本研究以感受态正常的Bacillus subtilis BR151P与其同源的感受态组成型缺陷的Bacillus subtilis BR151Pm为研究材料，运用蛋白质组学研究中的双向电泳技术研究了这一对感受态表型差异菌株在感受态建成时期细胞内外蛋白差异表达情况，采用ImageMaster 2D软件对电泳图谱进行分析，找出表达差异的蛋白。再从中选出重要蛋白进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术，确定蛋白的性质与功能。据此建立了2-DE结合质谱技术分离与分析感受态建成相关蛋白的方法。
分别采用一步培养法和两步培养法获得B.subtilis BR151P和B.subtilis BR151Pm的感受态细胞，经过细胞破碎、离心和提取等步骤得到处于感受态时期的胞内和胞外全蛋白，经过等电聚焦、胶条平衡后，进行SDS-PAGE电泳，获得感受态时期胞内和胞外全蛋白的2-DE图谱。比较这两种培养方法制备蛋白的2-DE图谱，二步培养法制备全蛋白的双向电泳图谱效果优于一步法。
采用两步法制备B..subtilis BR151P和B．subtilis BR151Pm感受态建成期胞内和胞外全蛋白，然后进行双向电泳。其中，B. subtilis BR151P感受态建成期胞内全蛋白双向电泳有295个蛋白点，B.subtilis BR151Pm有263个蛋白点。重点考察B. subtilis BR151Pm感受态建成期胞内全蛋白点中的下调点和缺失点，经过ImageMaster 2D软件计算和三维图谱分析，最后从中筛选出两个缺失点Pm269和Pm249，两个下调点Pm85和Pm188。从B. subtilis BR151P电泳胶上找出它们的对应点P269、P249、P85和P188蛋白点，利用基质辅助激光解析/电离串联飞行时间质谱技术对这4个蛋白点进行肽指纹图谱分析。结果发现其中的P249蛋白点为Nin蛋白，是枯草芽孢杆菌感受态建成的重要蛋白。Nin蛋白的缺失可能是B. subtilis BR151Pm菌株感受态缺陷的主要原因。P85蛋白点为RecA蛋白，其可能与感受态的建成有一定的联系。其它两种蛋白的性质和功能还未知。
Nin蛋白通过调节NucA核酸酶活性而影响细胞的转化能力，Nin蛋白的缺失能使NucA核酸酶活性提高，从而导致单链DNA通过细胞膜通道时容易被降解，造成转化成功率下降。nin基因产物的缺失，可使转化频率降低约10倍。B．subtilis BR151Pm菌株自然转化能力比正常菌株低2～3个数量级，表明B．subtilis BR151Pm菌株的感受态缺陷除与nin基因产物缺失有关外，还与其它的感受态建成相关基因的变异有关，很可能是与，nin基因上游调控基因突变相关。
枯草芽孢杆菌;感受态相关蛋白;感受态缺陷;双向电泳;质谱;蛋白质组学
河南师范大学
硕士
微生物学
刘国生;谢志雄
2007
中文
Q939.124;Q93-331
57
2007-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）