侵染蛋白介导的高效生产重组杆状病毒研究
1983年，Smith等用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(ACMNPV)作为载体在草地贪夜硪细胞(Sf9)中高水平表达了β-干扰素，从而建立了杆状病毒-昆虫表达系统，开辟了基因工程研究的新领域。二十多年来，杆状病毒一昆虫表达系统已成为基因工程领域最重要的表达系统之一，显示了强大的生命力，被应用到生命科学各个研究领域杆状病毒(Baculovirus)是一类基因组大小在90kb-180kb双链环状有囊膜的DNA病毒，在自然界中仅感染节肢动物，其感染宿主主要集中于鳞翅目昆虫．杆状病毒表达载体系统，可以高效正确表达真核系统。杆状病毒表达真核基因具有以下几个方面的优点：1杆状病毒在昆虫细胞体内复制，杆状病毒在昆虫体内表达产生的外源基因产物能够进行各种翻译后修饰，如糖基化、磷酸化折叠和二硫键形成等等，而且修饰的情况与在哺乳动物细胞内的情况一致或仅存在细微差异，这些翻译修饰确保了外源基因产物具有生物活性。2具有强的启动子，杆状病毒的polh和p10基因是两种超量表达基因，其表达时间从病毒复制周期的基因表达晚期延续到极晚期，其中polh的表达产物在病毒感染晚期可以达到细胞蛋白质总量的25％～50％。Polh和p10启动子是目前最常用的外源基因表达的启动子。3基因容量大，杆状病毒成棒状可以延伸，故可以容纳更大的病毒基因组。4杆状病毒的宿主范围仅限于昆虫和少数其它无脊椎动物，而且每种杆状病毒只能感染一种或少数几种昆虫，对宿主昆虫以外的生物类群无害，尤其是对人类和哺乳动物没有感染性。
昆虫杆状病毒表达系统是一个高效的真核表达系统，被广泛用于在昆虫细胞或昆虫幼虫中生产外源蛋白质。无论以何种方式构建重组杆状病毒，最后都必须通过将重组病毒DNA转染昆虫细胞产生杆状病毒粒子。目前将DNA载体(包括Bacmid)转染进昆虫宿主细胞的方法有脂质体(lipofectamine)介导的转染法，磷酸钙-DNA 共沉淀法，DEAE-葡聚糖介导的转染法和显微注射法。其中磷酸钙-DNA 共沉淀法对操作要求比较严格，尤其对PH值得精确度要求较高，PH微小的改变就可导致转染效率急剧下降，因此总体转染效率不高。脂质体介导的转染方法简单，且效率较高(60-80％之间)，但是脂质体价格极其昂贵，实验成本太高，依然需要提取和精制DNA后再与脂质体进行混合。DEAE-葡聚糖，是一种高分子量的多聚阳离子试剂。很多因素影响其转染效率，如DNA浓度，细胞的数量，且不能产生稳定的细胞系，目前很少使用。显微注射法操作过程烦琐，需要价值上百万的显微操作系统支持，成本极高，和操作者的经验密切相关，普通实验室根本不可能使用。以上所有的方法都需要制备高纯度的DNA，再通过和试剂进行混合才能转染进细胞。本实验我们构造了一种新的技术平台，可以在invasin侵染蛋白(inv)一种来自Yersinia pseudotuberculosis假结核耶尔森菌的帮助下，直接使用含目的重组杆状病毒Bacmid DNA的细菌感染昆虫细胞，从而直接获得重组病毒，是十分方便，快速和经济，为大规模构建重组病毒表达外源蛋白打下基础．Yersinia psetldotuberculosis是一种革兰式阴性菌，可以引起鸟类和哺乳动物爆发疾病，人类吃了感染该细菌的食物或者水，细菌进入人体，到达回肠末端，通过肠壁进入淋巴组织，引起急性肠炎，inv基因是Yersinia pseudotuberculosis来自染色体基因组，编码986个氨基酸，103kDa．的细菌外膜蛋白，可以促进细菌结合侵染人类和哺乳动物细胞。我们利用同源重组构建了一种细胞壁合成缺陷型的大肠杆菌DH10B-asd,asd是编码二氨基庚二酸的基因，是细胞壁的重要组成。由于asd基因的缺失，所以必须在培养基中加DAP(二氨基庚二酸)细菌才能合成细胞壁，PGB<,2>-inv质粒含有inv基因，可以表达侵染蛋白。我们在这里转化PGB<,2>-inv质粒进入大肠杆菌DH10B-asd-，然后电转AcBacmid-gfp进入大肠杆菌DH10B-asd-，构建菌株DH10B-asd-PGB2Ω-inv，我们将细菌菌液与昆虫细胞sf21直接混合，同时做脂质体介导的AcBacmid-gfp转染试验。在inv侵染蛋白的介导下，大肠杆菌通过细胞表面受体介导的内吞作用进入细胞，在缺乏DAP的情况下，细菌不能合成细胞壁，裂解。AcBacmid-gfp释放出来，复制，装配，表达gfp绿色荧光蛋白。转然四天后，在激光共聚焦下观察，可以看到报告基因绿色荧光蛋白表达。有20％左右，比用质脂体做的对照效率(％5)高约4倍，而且方法简单，经济。效率高效，且因为是氨基酸缺陷型的，所以安全性也很高。
杆状病毒;昆虫表达系统;基因工程;sf21;invasin蛋白;AcBacmid-gfp
河南师范大学
硕士
动物学
文祯中;姚伦广
2007
中文
S852.659.1;Q786
47
2007-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）