黑曲霉C2-56木聚糖酶（小麦抗营养因子降解酶）的分离纯化方法和性质研究
本试验在前期小麦抗营养因子降解酶黑曲霉C2-56成功筛选的基础上，运用层析和双水相萃取的方法研究了不同纯化方法对黑曲霉C2-56产木聚糖酶的纯化效果，并对纯化酶的性质进行了的研究，试验结果表明：
1、黑曲霉C2-56木聚糖酶组成上，通过凝胶过滤层析和离子交换层析两步分离得该酶由两种成分组成，命名为Xyn Ⅰ和XynⅡ，二者分子量分别为26.20kD和121.41kD，其中酶活力较高的是分子量较小的Xyn Ⅰ组分。
2、通过筛选得到黑曲霉C2-56木聚糖酶分离纯化较好的条件。70％饱和度的硫酸铵可使木聚糖酶活力和蛋白质含量都较高，确定粗酶硫酸铵分级沉淀的最佳浓度为70％。Test-tube试验法发现，当缓冲液pH值为6.0时，上清液中木聚糖酶的相对酶活明显低于6.0后的，故选择pH值6.0的柠檬酸缓冲液作为木聚糖酶上离子交换柱时的缓冲体系。
3、黑曲霉C2-56木聚糖酶纯化策略为：通过硫酸铵盐析、透析脱盐、Sephadex G-100凝胶过滤，DEAE Sepharose Fast Flow离子交换等方法，分离提纯到黑曲霉C2-56木聚糖酶中的Xyn Ⅰ和Xyn Ⅱ组分。两个组分分别达到电泳均一程度，Xyn Ⅰ组分的纯化倍数和回收率分别为10.53和4.09％，Xyn Ⅱ组分的纯化倍数和回收率分别为2.33和0.74％。针对层析法两组分回收率较低的问题，用双水相萃取技术尝试分离纯化效果，得对Xyn Ⅰ组分而言，当选择PEG6000系列时，当选择PEG浓度为5％，磷酸盐浓度为10％，NaCl浓度为20％，木聚糖酶起始浓度为20mg/mL时，酶回收率最高，达到94.09％，纯化倍数为2.81倍，回收率和纯化倍数都较高。对XynⅡ组分而言，当选择PEG6000浓度为25％，磷酸盐浓度为9％，NaCl浓度为5％，木聚糖酶起始浓度为20mg/mL时，酶回收率最高，达到79.09％，纯化倍数为1.12倍，具有较好的纯化效果。对层析法而言，木聚糖酶各组分的纯化倍数相对较高，但是经历了多步纯化过程后，酶的回收率很低；PEG/磷酸盐双水相萃取具有成本低、操作简单、收率高、纯化效果好等优点。针对不同的生产要求，我们可以选用不同的纯化条件和方法及其组合。
4、纯化酶的性质：Xyn Ⅰ组分最适反应pH值为6.0，最适反应温度为60℃，在pH9.5时酶活比pH6.0时下降了61.01％，在70℃处理60min，剩余酶活仅有原来的39％，说明Xyn Ⅰ组分耐热性和酸碱稳定性较差。XynⅡ组分最适反应pH值也为6.0，最适反应温度为55℃，在pH9.5时酶活比pH6.0只下降了28.99％，在70℃处理60min，剩余酶活仍有最高酶活的65％以上，说明该组分有较强的耐热性和耐碱性。Mg<'2+>、Cu<'2+>、K<'+>、Na<'+>、Ag<'+>、Zn<'2+>、Ca<'2+>对Xyn Ⅰ有极显著的促进作用，Hg<'2+>和Fe<'2+>对其有极显著的抑制作用。Na<'+>对Xyn Ⅱ有显著的促进作用，Mn<'2+>、Ag<'+>对其有极显著的抑制作用。
小麦;抗营养因子;降解酶;纯化效果
河南师范大学
硕士
植物学
李春喜
2007
中文
Q946;S512.101
58
2007-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）