α-Synuclein转基因细胞模型建立及三个单体化合物的细胞保护作用研究
帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，其特征是黑质多巴胺能神经元选择性减少以及路易小体(Lewy body，LB)小体形成，多见于老年人。目前该病的发病机制仍不十分明了，目前认为可能与线粒体功能障碍、氧化应激反应增强导致活性氧自由基(reactive oxygen spices，ROS)过多有关。大量的流行病学研究表明，许多环境毒素与PD病人的黑质多巴胺神经元丢失有关。外源性多巴胺(Dopamine，DA)和1-甲基-4-苯基-吡啶盐(1-methyl-4-phenyl-pyridinium ion，MPP<'+>)能对多巴胺能神经元造成选择性伤害，产生与PD类似的临床特点及病理改变，成为制造PD体外模型的工具药。SH-SY5Y细胞(人骨髓神经母细胞瘤)在细胞形态、结构和功能上与神经元极其相似，其含有的膜受体及合成的递质与黑质多巴胺能神经元相似，因此该细胞株可以作为多巴胺能神经元模型，用于相关研究。
本研究分为两部分，第一部分内容为人G209A突变型α-synuclein转基因细胞模型建立。第二部分内容包括：(1)对140个单体化合物进行抗氧化应激方向筛选；(2)对三个分离自小蜡树皮的单体化合物的神经细胞保护作用进行初步研究。
在第一部分实验中，成功建立了可以在体外过表达人G209A突变型α-synuclein蛋白(A53T)的转基因细胞模型。选择SH-SY5Y细胞，采用RT-PCR法扩增人α-synuclein基因。T-A克隆后，运用大引物法及重叠延伸两种方法进行定点突变，得到G209A突变型α-synuclein基因。经过Xbal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后，将突变型α-synuclein基因插入pcDNA3.1(+)真核表达载体中，然后运用双酶切及DNA测序证实其成功连接并且序列正确。随后进行真核细胞转染及单克隆筛选，得到稳定过表达突变型α-synuclein蛋白的的细胞单克隆。通过Western blot证明不同的单克隆过表达外源蛋白的量是不同的，选择过表达量最高且无明显致死作用的三号单克隆进行后续研究。应用免疫细胞化学方法对外源蛋白表达量及定位进行了检测，与阴性对照组及转染空载体组相比，稳定转染的细胞呈显著免疫阳性染色，并广泛分布于胞浆及突触内，但并未形成明显的包涵体。运用RT-PCR方法，对三号单克隆的外源基因进行了转录水平检测，结果与蛋白表达水平相符，其转录水平也明显上调。在给予多巴胺和MPP<'+>24，48及72小时后，比较正常细胞、转染空载体细胞与稳定转染细胞的存活率差异。结果显示，过表达突变型α-synuclein的细胞对于二种神经毒素的敏感性显著高于对照组。应用Armexin V-FITC和propidium iodide(PI)双染流式细胞术对不同组细胞的早期凋亡及晚期凋亡/坏死进行了检测，与细胞存活率实验结果一致。在给予MPP<'+>后，过表达突变型α-synuclein的细胞的早期凋亡及晚期凋亡/坏死明显高于正常对照组和转染空载体对照组。此外，MPP<'+>可以导致稳定转染细胞产生细胞凋亡是典型的“Ladder”样DAN剪切，而对照组却并未产生些现象。在第一部分实验中，证明了过表达人G209A突变型α-synuclein蛋白后，细胞对于外源性多巴胺和MPP<'+>产生的细胞毒性作用较正常细胞更为敏感。同时，成功建立了转基因细胞模型，为构建转基因动物模型及进一步研究α-synulein基因功能及基因突变与帕金森氏病之间的关系奠定了一定基础。 在第二部分实验中，首先应用MTT法对140个候选单体化合物进行了初筛，随后选择三个分离自小蜡树皮的小分子单体化合物(Esculin；6,7-di-O-glucopyranosyl-esculetin；liriodendrin)进行了进一步研究。结果显示，三个化合物在在10<'-8>，10<'-7>，10<'-6>，10<'-5>和10<'-4> mol/L浓度下，对SH-SY5Y细胞的存活率(Cellviability)未产生影响，说明其本身可能不具有细胞毒性作用，但是可以明显抑制多巴胺诱导的细胞存活率下降。在10<'-7>，10<'-6>及10<'-5>mol/L三个浓度作用下，线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP，ΔΨm)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性和还原型谷胱苷肽(Glutathione，GSH)水平与多巴胺处理组相比，均有显著性提高；同时减少作为细胞损伤标志的乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)的释放；荧光标记实验结果表明，三个化合物均可明显逆转多巴胺诱导的细胞活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)水平升高；双染流式细胞术显示，三者具有显著的抗细胞凋亡和坏死作用。进一步机制研究结果证实，三个化合物可以调节细胞凋亡基因开关Bax/Bcl-2比率和抑癌基因P53转录水平的表达，减少线粒体内细胞色素C(Cytochorme c，Cyt c)及凋亡诱导因子(Apoptosis Induced Factor,AIF)的释放；还可以降低细胞凋亡执行期主要因子caspase-3的剪切。综上所述，这三个小分子单体化合物对多巴胺诱导的细胞损伤有明显保护作用。推测主要机制可能与其调节细胞氧化应激反应及细胞凋亡的信号转导通路有关，提示该化合物可以作为治疗退行性神经疾病如帕金森氏病等的候选化合物，其临床应用价值有望在今后的动物实验和临床实验中得到进一步证实。
帕金森氏病;细胞模型;神经保护作用;线粒体;细胞凋亡
沈阳药科大学
博士
药理学
邹莉波;朱海波
2007
中文
R963;R971.5
144
2007-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）