复方血栓通抗糖尿病视网膜病变神经细胞凋亡的动物研究
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus DM)最为常见和严重的微血管并发症之一，也是成人盲的主要致盲性眼病之一。DR病理改变主要有毛细血管周细胞选择性凋亡，微血管基底膜增厚，内皮细胞增生，微动脉瘤形成，以及新生血管形成等一系列改变。以往的大部分对糖尿病的研究都集中在对毛细血管渗透性的改变上，但是近来越来越多的研究表明视网膜其他细胞的病理性改变如神经细胞的凋亡以及胶质细胞的活化等等。有研究表明视网膜神经细胞的凋亡在DR的发展中起着重要的作用。神经细胞的凋亡和损害提示疾病的过程是不可逆的，所以研究糖尿病视网膜病变早期神经细胞凋亡机制以及有效的治疗方法是很有必要的。
复方血栓通胶囊是由三七、丹参、玄参、黄芪组成的纯中药制剂，临床观察认为该药能有效地防治糖尿病性视网膜病变，在增殖期糖尿病性视网膜病变手术治疗后也有辅助功能。大量的研究显示其中的三七、丹参、黄芪均有不同程度的抗凋亡作用。
本研究就复方血栓通对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡防治效果进行研究，具体如下：
目的：探讨复方血栓通对糖尿病大鼠视网膜病变神经细胞凋亡的干预效果，并研究其机制。
方法：STZ(链脲佐菌素)诱导糖尿病大鼠成功后，随机取20只糖尿病大鼠和10只正常Wistar大鼠分成3组：
正常组：正常大鼠组；
对照组：糖尿病大鼠非治疗组；
治疗组：糖尿病大鼠，接受复方血栓通(900mg/kg/day)治疗；实验进行到第12周的时候，做如下处理：
(1)视网膜消化铺片研究：每组取6只动物，麻醉后取其一只眼球进行石蜡包埋、切片，HE染色进行病理形态观察，节细胞计数以及内核层厚度测量；
(2)采用荧光免疫组织化学的方法检测视网膜组织中Caspase-3的表达量；
(3)提取视网膜组织的蛋白，采用分光光度法检测各组动物视网膜组织中Caspase-3的活力；用Western-Blot的方法检测组织中Bcl-2以及Bax蛋白的表达量；
(4) 提取视网膜组织当中的RNA，反转录，PCR，电泳以检测组织中Bcl-2以及Bax在。RNA水平的表达。
结果：
(1)各组大鼠的一般情况正常组：正常组大鼠精神正常，毛色光亮，运动灵活。
对照组：对照组大鼠可观察到精神倦怠、萎靡，毛色枯槁，“三多一少”症状明显。
治疗组：同对照组一样表现出精神萎靡，毛色枯槁，“三多一少”症状也很明显。
(2)视网膜形态学改变HE染色：正常组大鼠视网膜各层结构清楚，层次分明，排列整齐，各级神经细胞大小均匀；节细胞层排列整齐，胞核清楚，染色深，内核层约5-6层细胞，胞核清楚，染色深，排列紧凑。对照组大鼠视网膜神经节细胞排列紊乱，数目减少，细胞空泡样变，核固缩，部分核溶解。内外丛状层变薄，内核层变薄，细胞数目减少，排列紊乱，染色不均匀。治疗组大鼠视网膜神经节细胞排列紊乱，数目有所减少，较对照组增多。少量细胞出现空泡样变，内核层轻度变薄，内外丛状层厚度未见明显改变。
视网膜神经节细胞计数发现正常组大鼠视网膜神经节细胞为(21.65±2.13/HP)，对照组大鼠视网膜神经节细胞数目明显变少(15.56±1.13/HP)，治疗组相对对照组有所增多(18.87±1.29)。
视网膜内核层厚度测量发现正常组的大鼠内核层为(15.56±1.47 u m)，对照组相对正常组变薄(10.70±1.31 u m)，而治疗组的大鼠视网膜内核层厚度又有所增加(3)Caspase-3在视网膜组织中的表达及活力检测正常组大鼠视网膜组织当中未见到或见到极少量Caspase-3阳性细胞 (9．37±4．12／HP)；对照组大鼠视网膜节细胞层及内核层见大量Caspase-3阳性细胞 (88．75±9．89／HP)；治疗组大鼠视网膜组织当中Caspase-3阳性细胞数相对对照组减少(64．27±9．32／HP)。
与正常组(0．0875±0.01852)相比，对照组大鼠视网膜组织当中Caspase-3酶的活力增高(0.24825±0.01360)，而经过复方血栓通的治疗糖尿病大鼠视网膜组织当中Caspase-3酶的活力减低(0.1575±0．02949)。
(4)视网膜组织当中Bcl-2和Bax的表达与正常组相比，无论是RNA水平还是蛋白水平对照组大鼠视网膜组织当中的Bcl-2的表达下降，而Bax的表达增高，而与对照组相比，治疗组大鼠的视网膜组织当中的Bc卜2的表达增高，而Bax的表达是下调的。
结论：
(1) 用STZ诱导糖尿病大鼠是一种研究糖尿病视网膜病变较好动物模型；
(2)在12周的时候糖尿病大鼠的视网膜神经节细胞以及内核层神经细胞出现凋亡，而复方血栓通治疗后发生凋亡的神经细胞减少；
(3)12周时糖尿病大鼠视网膜组织中的Caspase-3表达增多、活力增高以及 Bcl-2与Bax的比值减低可能是糖尿病大鼠神经细胞发生凋亡的机制；
(4)复方血栓通可能是通过降低糖尿病大鼠视网膜组织当中的Caspase-3的表达以及活性，并且调节凋亡相关基因Bc1-2与Bax的表达来发挥对视网膜神经细胞的保护作用的。
复方血栓通;糖尿病视网膜病变;细胞凋亡;糖尿病并发症
中山大学
硕士
眼科学
于强
2007
中文
R774.1;R587.2
45
2007-09-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）