草菇冷诱导相关基因的克隆及分析
草菇(Vohvariella volvacea)是一种高温型食用菌，具有较高的营养价值和保健价值，在我国已有悠久的栽培历史。同大多数热带和亚热带作物一样，草菇不耐低温冷藏，在常规低温冷藏条件下(4℃)，其菌丝会发生自溶死亡，子实体亦会发软、液化，这一特性严重限制了草菇的生产、新鲜草菇的流通、低温冷藏保鲜和出口创汇以及草菇菌种的低温保藏，制约了草菇在中国甚至在世界的发展。目前草菇低温自溶的根本原因及其作用机制还难以阐释清楚。本研究利用分子生物学手段，对草菇在低温条件下基因表达的变化进行探索。首先，本实验通过RACE的方法克隆了草菇的gpd基因，从转录水平上探讨了草菇gpd基因在低温条件下的表达量情况，以期了解gpd基因与草菇低温应答的关系，建立了以gpd为内标基因检测草菇冷诱导相关基因在低温条件下转录水平的半定量RT-PCR方法。其次，利用SMART<'TM> cDNA文库构建试剂盒构建了草菇低温全长cDNA文库，采用本实验室已经分离到的草菇低温诱导基因片断为探针筛选cDNA文库，得到低温相关的全长基因，并克隆其上游调控序列，在基因水平上探讨低温诱导相关基因在草菇低温代谢途径中所起的作用，从而为了解草菇低温应答的分子机理提供依据，为进一步利用基因工程技术培育草菇新品种、进行草菇低温保鲜和保藏奠定了理论基础。
1、草菇gpd基因的克隆根据已发表文献中扩增gpd片断的简并引物，以草菇基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得大小为685bp的草菇gpd的基因片断。根据这一特异性片断，设计专一引物，与RACE试剂盒中的接头引物结合，扩增得到gpd基因的5’和3’端序列，再根据5’和3’端序列设计引物，扩增得到草菇gpd基因的全长cDNA序列，该序列全长为1155bp，编码337个氨基酸残基。
根据全长cDNA序列设计引物，扩增草菇基因组DNA，得到草菇gpd的全长基因组序列，该序列全长为1635bp，基因由10个外显子和9个内含子组成。它们的长度分别为3bo(extronl)、59bp(intronl)、23(extron2)、64(intron2)、5(extron3)、47(intron3)、70(extron4)、50(intron4)、25(extron5)、59(intron5)、168(extron6)、54(intron6)、23(extron7)、48(intron7)、118(extron8)、51(intron8)、248(extron9)、48(intron9)、331(extron10)。Southern blot杂交结果显示，在草菇基因组中，gpd以单拷贝的形式存在。根据基因组全长，设计两个嵌套引物，与Takara LAPCR in vitro cloning试剂盒的接头引物结合进行巢式PCR的扩增，得到草菇gpd基因的上游启动子序列，序列分析发现，该序列含有两个TATA盒和三个CAAT盒，具有启动子的基本特征，为建立草菇遗传转化体系提供了重要的元件。
草菇菌丝经过4℃不同时间(0，2，4，8，12h)的处理后，提取RNA，以gpd基因片断为探针进行Northern blot分析，在正常培养条件下和在4℃条件下，草菇gpd的mRNA表达量没有变化，并且在4℃条件下不同的处理时间，gpd的mRNA量也没有发生变化。因此认为gpd不参与草菇的低温应答过程，gpd可以作为草菇冷诱导相关基因转录水平研究的内标基因。
2、草菇冷诱导相关基因的克隆选择4℃处理2h的草菇菌丝，提取RNA，利用SMART<'TM> cDNA文库构建试剂盒构建了草菇低温全长eDNA文库，用草菇低温诱导特异性片断为探针筛选cDNA文库，得到4个冷诱导相关全长基因，分别命名为cor1、cor2、cor3和cor4。序列同源性分析发现，cor1和cor2基因与其它真菌未知功能的蛋白有较高的同源性，cor3基因与其它物种的sahh基因具有较高的同派}生，cor4与40S核糖体蛋白S9基因有很高的同源性。
将cot3 eDNA序列经EcoR I酶切克隆到原核表达载体pPROK-1中，转化大肠杆菌JMl09，经IPTG诱导表达、分别经过DE-52纤维素，Sephacryl S-200凝胶柱和QAE-Sepharose阴离子交换柱分离纯化出的蛋白经SDS-PAGE电泳发现，该蛋白的分子量约为43KD，等电聚焦电泳结果表明，该蛋白的等电点为6.1，HPLC检测说明合成方向的酶活性为4.5μmol/min/mg protein，DNTB与同型半胱氨酸颜色反应测定水解方向的酶活性为0.7μmol/min/mg protein，可以确定cor3所编码的蛋白是SAHH。
根据sahh全长cDNA序列设计引物，扩增草菇基因组DNA，得到草菇sahh的基因组全长序列，序列分析结果表明，sahh共有1868bp，编码430个氨基酸残基，基因由12个外显子和11个内含子组成，它们的长度分别为19bp(extronl)、49bp(intronl)、47(extron2)、51(intron2)、36(extron3)、70(intron3)、53(extron4)、47(intron4)、70(extron5)、53(intron5)、35(extron6)、52(intron6)、179(extron7)、45(intron7)、236(extron8)、49(intron8)、212(extron9)、56(intron9)、150(extron10)、51(intron10)、238(extron11)、52(intron11)、18(extron12)。草菇sahh推断的氨基酸序列与其它物种的SAHH氨基酸序列比较发现，sahh保守性较高。根据基因组全长z，设计两个嵌套引物，与Takara LA PCR in vitro cloning试剂盒的接头引物结合进行巢式PCR的扩增，得到sahh的上游调控序列，通过序列分析发现，该序列含有一个TATA盒和四个CAAT盒。应用MatInspector程序分析sahh的上游调控序列，发现该区域存在1个耐盐因子，1个热激因子，2个DRE元件和2个ABA应答元件。
以草菇gpd为内标基因，用半定量RT-PCR方法分析草菇sahh的表达谱，发现草菇菌丝4℃低温处理4h时，sahh表达量达到最高，4h后表达量迅速降低，6h后低于未处理的表达量。说明sahh参与了草菇的低温应答过程。
草菇;内标基因;原核表达;表达谱;冷诱导;基因组DNA;基因组序列
南京农业大学
博士
微生物学
潘迎捷;陈明杰
2006
中文
S646.13;S601
135
2007-09-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）