mAChR、VIP在豚鼠FDM模型中表达的实验研究及PRK、LASIK远期效果的临床研究
研究背景
临床试验中已经证实，应用非选择性毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR)抑制剂阿托品能够有效地延缓近视的进展。另一种非选择性mAChR-oxyphenonium，也能够抑制小鸡的形觉剥夺性近视(FDM)。目前为止，已经确定mAChR有五种不同的亚型(M1～M5)。对选择性的mAChR抑制剂的研究表明，哌仑西平(选择性M1受体抑制剂)、喜巴辛(选择性M2/M4受体抑制剂)在两种动物模型中(小鸡及树鼠)均能够通过抑制眼球伸长从而延缓近视进展。但是，它们的作用机制目前仍不明了。
阿托品、哌仑西平及喜巴辛通过玻璃体注射时均能抑制FDM，因此最初认为他们是通过结合视网膜上的mAChR而发挥作用的。然而，对小鸡视网膜及猴视皮质的研究表明M1和M4的密度及亲和力在FDM组及对照组间均无差异。此外，破坏视网膜上的mAChR及胆碱能无长突细胞均不能抑制眼球的轴性增长。在脉络膜上的研究也表明mAChR在正常眼和近视进展眼上的表达没有差异。因此，巩膜就被合理地推测为mAChR抑制剂的潜在作用位点。事实上，体外研究己表明阿托品对巩膜细胞具有直接抑制作用；近期的一项研究也表明所有的mAChR亚型(M1～M5)，从mRNA及蛋白水平上在人类巩膜上均有表达。但是，目前对视觉调控眼球生长眼上mAChR的表达是否发生变化的研究还未见发表。
血管活性肠肽(VIP)作为一种神经肽递质，广泛分布于全身各器官组织中，发挥广泛而重要的信息传递和生理调控功能。已有研究表明，灵长类动物FDM模型中视网膜内丛状层的无长突细胞亚型中VIP的表达明显上调；近期的基因水平上的研究也证实了这种结果。目前的观点认为，异常的视觉输入导致了一类无长突细胞释放VIP增加，VIP这种多肽反过来刺激了视网膜周边前体细胞的增殖，从而引起视网膜生长，促进眼球增长。这种观点需要在FDM模型中从不同水平进行验证。目的研究豚鼠FDM模型中mAChR在视网膜及巩膜上的表达、VIP在视网膜上的表达，以探讨它们在近视形成中的作用。
材料与方法
1、实验动物与形觉剥夺近视模型的建立
选择30只健康豚鼠，年龄12～14天，体重66～112g，随机分为实验组(n =15)和对照组(n=15)，在“12小时亮/12小时暗"的光线环境下饲养。实验组豚鼠随机选择一眼进行形觉剥夺，另一眼开放；对照组豚鼠双眼开放。形觉剥夺时限为14天，处于豚鼠的正视化期。
形觉剥夺的建立：制作直径为2cm的黑色橡胶环及橡胶片各15个固定于处理组豚鼠单眼周围皮肤，建立形觉剥夺。
屈光度的测量：所有实验动物在实验前后均进行屈光度测量。检查前1小时双眼结膜囊内滴0.5﹪托比卡胺6次，每10分钟1次。在暗室内由同一验光师用带状光检影镜分别进行水平和垂直径线上的检影验光，屈光度以等效球镜值(球镜值+1/2柱镜值)表示，梯度为0.25D。
眼轴长度的测量：所有实验动物在实验前后均进行眼轴长度测量。结膜囊内滴0.5﹪地卡因2次，同一操作者用A型超声以手动模式测量眼轴长度，连续测量5次，取平均值。眼轴长度定义为在眼轴上从角膜前表面至视网膜前表面的距离。
2、组织收集
形觉剥夺结束后，过量麻醉法(2﹪戊巴比妥钠)处死动物。摘除眼球，去除结膜、筋膜、眼外肌等组织，用剪刀沿锯齿缘部环形剪开眼球壁，去除眼前节组织与玻璃体，浸泡于充分的Ames液中。将眼杯剪为两半，在液态(BBS液)无菌环境下剥离视网膜神经上皮，刮除并清洗附着在巩膜上的色素上皮及脉络膜。
将视网膜神经上皮及巩膜组织分别处理。用于HE染色及免疫组织化学检测的组织固定于眼球专用固定液(每100ml含40﹪甲醛10ml、冰醋酸5ml、95﹪酒精50ml、蒸馏水35ml)中：用于Western印记的组织立即提取组织蛋白，放入-80℃低温冰箱保存；用于RT-RealtimeRCR检测的组织立即提取总RNA，放入-20℃冰箱保存。
3、实时定量RT-PCR检测M1～M4应用Trizol法提取视网膜及巩膜中的总RNA，操作步骤按照说明书执行。用DNA酶对提取的总RNA进行处理以消除内源性DNA污染。应用M-MLV试剂盒在37℃1小时条件下将RNA逆转录为cDNA，然后应用实时定量PCR仪进行扩增。SYBR Green 1试剂盒用于检测Ml～M4及VIP在mRNA水平上的扩增及检测。定量值从循环域值(荧光第一次显著增长的时间点)获得。管家基因β-actin作为定量RNA的内参照。目的条带的大小通过琼脂糖凝胶电泳确认。数据分析应用2越<'CT>法。
4、免疫组织化学标本以眼球专用固定液浸泡固定、石蜡包埋，切片厚度5μm；将组织切片梯度脱蜡至水。脱腊后蒸馏水洗涤，3﹪H<,2>O<,2>作用15分钟阻断内源性过氧化物酶。5﹪正常牛血清(PBS稀释)封闭非特异性结合位点。滴加稀释后的一抗(M1～M4及VIP多克隆抗体)，4℃过夜。M1～M4检测用辣根过氧化物酶标记的二抗。滴加DAB显色，镜下观察。VIP采用FITC标记的二抗后直接镜下观察。阴性对照应用PBS代替一抗。
5、Western印迹蛋白煮沸5分钟。等量的蛋白通过14﹪的SDS-PAGE分离并转到硝酸纤维素膜上。用5﹪的脱脂牛奶阻断后，印迹用含有0.1﹪Tween20的PBS冲洗，加合适浓度的一抗4℃过夜。一抗分别为内参β-actin、抗M1～M4及抗VIP的多克隆抗体。过夜后，印迹用TBST冲洗，然后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时。冲洗后用增强化学发光法进行显影。蛋白条带的相对浓度用MSF-300G型扫描仪进行分析。
6、统计方法
数据以均数士标准差表示。独立样本f检验用于比较实验组与对照组之间的差异。P值小于0.05被认为有统计学意义。统计分析及作图应用SPSS13.0软件。
结果:
1、形觉剥夺后的屈光状态形觉剥夺12天后的屈光状态：对照眼呈轻度远视状态(平均0.8D)，形觉剥夺眼呈近视状态(平均-5.8D)。超声测量显示形觉剥夺眼的眼轴长度明显高于非形觉剥夺眼(P<0.05)。
2、mAChR及VIY的mRNA水平的表达mAChR：M1～M4在视网膜及巩膜上均有mRNA水平上的表达。PCR扩增产品的大小与各自预期的大小相符。阴性对照组无扩增产品出现，表明已用DNA酶处理的样品中无DNA基因组的污染。视网膜及巩膜组织中，形觉剥夺组与对照组的M1～M4受体的mRNA的表达均无差异(P值分别为0.671、0.330、0.866、0.516)。
VIP：VIP在各标本视网膜中均有mRNA水平上的表达。实验组视网膜中VIP的表达明显高于对照组(P=0.000)。
3、mAChR蛋白的表达
3.1免疫组织化学mAChR：视网膜中，免疫组织化学染色显示所有的mAChR亚型(M1～M4)均可见于形觉剥夺组及对照组。M1～M4受体的免疫活性主要位于内核层的双极细胞，在无长突细胞中也有零散分布，并可见于节细胞层的部分细胞。M3和M4，受体比M1及M2的免疫活性要明显强烈，但这4种受体在实验组与对照组之间的表达均没有明显的差别。巩膜中，免疫组织化学染色也显示M1～M4受体均可见于形觉剥夺组及对照组中。阳性染色呈黄色纺锤状(成纤维细胞)，4种受体在实验组与对照组之间的表达均没有明显的差别。
VIP：免疫荧光显示VIP在FDM组及对照组视网膜中均有表达，主要位于内丛状层(IPL)。FDM组的荧光信号比对照组明显强烈。
3．2Western印迹分析mAChR：Western印迹分析显示M1～M4受体蛋白存在于视网膜及巩膜组织中。Ml条带位于52kDa、M2条带位于72 kDa、M3条带位于75 kDa、M4条带位于70 kDa。此外，视网膜和巩膜的M3及M4条带明显比M1及M2条带强烈。每种受体蛋白在视网膜上的表达均高于巩膜。但视网膜及巩膜组织中，形觉剥夺组与对照组的M1～M4受体蛋白的表达均无差异(P>0.05)。VIP：Western印迹分析显示VIP蛋白存在于视网膜中，条带位于20 kDa处。VIP)在FDM组中的表达明显高于对照组(P=0.003)。
结论:
1、mAChR在豚鼠FDM模型视网膜及巩膜上的表达与对照组没有差异。mAChR抑制剂抑制眼球生长的作用是通过视网膜外和巩膜外的M受体机制或通过非M受体机制而发挥的。
2、VIP在豚鼠FDM模型视网膜上的表达高于对照组，vIP在视觉诱导近视眼形成中对促进视网膜的生长发挥了重要作用。
乙酰胆碱受体;血管活性肠肽;形觉剥夺性近视;视网膜;巩膜;FDM模型
山东大学
博士
眼科学
李镜海
2007
中文
R774.1;R778.11
116
2007-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）