TGF-β<,2>反义寡核苷酸对兔角膜损伤修复的影响
目的及意义
眼外伤在临床上极为常见。角膜由于其解剖和生理特点，位于眼球的最前端，暴露于睑裂之中，且为一透明而规则的屈光界面，因而，极易遭受各类外伤的侵袭。角膜创伤愈合后，常遗留瘢痕而形成角膜散光，影响视功能的恢复和美观。
角膜创伤的修复是一系列的动态级联过程，通常包括角膜基质细胞，即成纤维细胞的激活、增生、分化、细胞因子的释放、细胞外基质的合成和重建等，此过程是由多种细胞和细胞因子在时间和空间上高度协调而完成的。越来越多的研究表明转化生长因子-beta(Transforming growth factor-B，TGF-β)在机体伤口愈合过程中起到重要的调节作用，其中。TGF-β<,2>是角膜创伤修复的启动因子，通过调控TGF-β<,2>的活性可调控角膜创伤的修复过程。本实验采用实验动物兔制作角膜穿孔伤模型，设计应用TGF-β<,2>的反义寡核苷酸(TGF-β<,2> antisenseoligonucleotide,TGF-β<,2> ASON)转染角膜外伤缝合术后的瘢痕组织，然后通过裂隙灯观察、HE染色、免疫组化和荧光定量PCR等检测手段从大体形态、组织结构、细胞蛋白数量及基因水平等不同层面观察分析TGF-β2反义寡核苷酸对TGF-β2的活性的影响，为实现药物干预减少瘢痕形成以控制外伤性角膜散光的设想提供理论依据。
材料与方法：
(1) FGF-β<,2>反义寡核苷酸(anti-sense oligodeoxynucleotide，ASON)的制备：根据兔TGF-β2 mRNA序列(Gene bank号AY429466)，由上海生工生物技术有限公司合成一段 21 bp 的 ASON，其序列为 5'．AGAAGTTGGCATTATACCCTT-3'，并合成一段错义寡核苷酸(missense oligodeoxynucleotide， MSON) 作为对照，其序列为5'-GCGATCTGGCATTATACCCIT-3'。
(2) 选用清洁级健康无眼病的新西兰大白兔24只，雌雄兼用，月龄为3个月。
随机分组：实验组16只，双眼均制备角膜穿孔伤缝合术后模型。左眼术后滴TGF-β<,2> ASON，为TGF-β<,2> ASON组：右眼滴生理盐水，为生理盐水组；对照组8只，不做手术，同样左眼滴TGF-β<,2>ASON，右眼滴生理盐水。
标本制作：两组分别于手术后4、7、14、28天取角膜标本，每次6只兔子(实验组4只，对照组2只)；角膜的三分之一石蜡包埋，三分之二—80℃冰箱中保存。
(3) 裂隙灯观察
HE染色
免疫组化
Real time PCR检测
结果：
(1) 裂隙灯观察：TGF-β<,2> ASON组：球结膜轻度充血，角膜缝线附近水肿，前房闪辉(0～＋)，虹膜纹理清晰，瞳孔圆居中，眼压均正常。随着时间的延长，眼前段炎症反应逐渐减轻，至术后1周完全消失。生理盐水组：角膜明显水肿，前房闪辉(＋～＋＋)，虹膜纹理不清晰，瞳孔欠圆，眼压均正常，角膜缘同时期出现大量新生血管。随着时间的延长，眼前段炎症逐渐减轻，至术后2周完全消失，但角膜缘新生血管未消退。
(2) HE染色组织病理学观察：
TGF-β<,2> ASON组：术后4d上皮细胞生长1～2层，基质层成纤维细胞体积增大，扁平，数量增多，平均每个高倍镜下9个染色细胞；术后7d，上皮增生4～5层，排列不规则，基质层成纤维细胞数目增多，平均每个高倍镜下12个染色细胞；术后14d，上皮基本趋于完整，基质层成纤维细胞数量少；胶原纤维排列疏松。生理盐水组：术后4d上皮细胞生长4～6层，基质层成纤维细胞体积增大，扁平，数量增多，平均每个高倍镜下21个染色细胞：术后7d，上皮增生4～5层，排列不规则，基质层成纤维细胞数目增多，平均每个高倍镜下18个染色细胞；术后14d，上皮层排列稍有些不规则，基质层成纤维细胞数量增生；胶原纤维排列致密紊乱。对照组滴TGF-β<,2> ASON的和生理盐水的高倍镜下表现一致。说明TGF-β<,2>ASON对正常角、节膜无副作用。
(3)免疫组化观察：
①角膜创伤后，生理盐水组a-SMA阳性的成纤维细胞数术后4 d达到高峰，术后14 d尚有少许a-SMA阳性的成纤维细胞；TGF-β<,2>ASON组a-SMA阳性的成纤维细胞数则术后7d达到高峰，术后14d回到基线水平，随着造模时间的延长，a-SMA阳性的成纤维细胞数逐渐减少；并且在术后4d和7d TGF-β<,2>ASON组的a-SMA阳性的成纤维细胞数都比生理盐水组的少，而且差异具有统计学意义(P<0.05)。
②FN：可见TGF-β<,2>ASON组FN染色明显减弱，呈板层散在分布于角膜伤口周围的基质层内；生理盐水组FN呈浓密板层分布于伤口周围的基质层内。
(4)Real time PCR检测结果：
TGF-β<,2> ASON组中TGF-β<,2>的4d、7d、14d、28d相对表达量分别为0.0851±0.0028、0.1389±0.0079、0.0753±0.0026、0.0658±0.0007；生理盐水组中TGF-β<,2> 的4d、7d、14d、28d相对表达量分别为0.1943±0.0094、0.1915±0.0101、0.1623±0.0090、0.1318±0.0134，同时期两组比较差异均有统计学意义(p<0.05)。
结论：
1．TGF-β<,2> ASON可特异性的阻断TGF-β<,2>的转录和翻译，从基因水平抑制TGF-β<,2>mRNA的合成并影响TGF-β<,2>活性，从而调控角膜损伤修复的愈合过程，即抑制成纤维细胞的活化增生、胶原和纤维连接蛋白等ECM的堆积，从而发挥抗瘢痕化的作用。
2．角膜损伤缝合术后成纤维细胞移行、增生最活跃的时期是术后4 d～7 d，14 d左右基本恢复到基线水平。TGF-β<,2>反义寡核苷酸对a-SMA阳性的成纤维细胞数明显的抑制作用也是在术后的14天以内。因此，从理论上讲具备了既促进角膜愈合又有抑制角膜瘢痕形成的双重作用，在角膜损伤修复这个动态级联过程的早期，即术后14 d内进行干预调控是减少术后瘢痕形成的关键。
3.实时荧光定量RT-PCR对于检测兔角膜这样微量标本的基因表达是一个切实可行的技术，具有特异性高、定量准确、结果可靠及可重复性强等优点。
眼外伤;定量PCR;HE染色;免疫组化;反义寡核苷酸;角膜损伤修复
郑州大学
硕士
眼科学
郑广瑛
2007
中文
R772.2
55
2007-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）