深低温冷冻保存角膜内皮细胞活性的实验研究
角膜移植术是角膜盲患者恢复视力的主要手段。随着设备和技术的进步，角膜保存方法据其对角膜内皮细胞(corneal endothelial cell，CEC)保存的活性可分为活性保存和非活性保存；另外还可按保存的时间又分短期、中期、中长期和长期保存；目前已采用的角膜保存方法还不尽完善，因此有的保存期短，不能随时满足临床的需要；有的则易造成污染；有的还有许多问题有待进一步研究；唯有深低温保存角膜，不仅保存期限长达数月至数年，而且保存材料优良，细胞活性接近新鲜角膜，用于穿透角膜移植术后透明率与新鲜角膜相仿。另外最新的组织工程也都在积极发展，针对角膜的保存技术已出现了玻璃化保存法，这一方面在国外研究比较多，但国内在这一领域还处于空白。
目的
借助于程序控制降温仪通过深低温冷冻保存法找到理想的保存角膜内皮细胞活性的条件，这一优点是其它任何短中期保存方法不可比拟的，是目前眼库保存角膜的最理想的方法。
材料和方法
选用清洁级新西兰大白兔75只，个体质量2.5～3.0kg，雌雄不限，由河南省动物中心提供，实验前于裂隙灯下检查眼前节均为正常眼。本实验均取兔子双眼角膜片，其中3只作为对照组，其余147只按照随机数字表随机分组，每种方法均采用三只角膜片作为实验组。角膜片首先经过冷冻预处理，然后调节程控降温仪其中一种程序进行冷冻降温直至．80℃，最后放到．196℃液氮保存。气体栓塞处死兔子后，摘除完整眼球，迅速拿至无菌室备用，沿角巩膜缘外1～2mm将角膜全层剪下，小心放于已备好的角膜瓶中，取组一液2ml加入其中，4℃冰箱浸泡10分钟。依次在组二，组三，组四液中浸泡10分钟，最后放于程控降温仪中，调至其中一程序降温直到结束后，最后将角膜瓶放入液氮中。保存一定时问后复温，将角膜瓶从液氮中取出，迅速在40℃下复苏融冻约1分钟后即可取出，最后移除角膜瓶中的冻存液并再加入含有20％(Fetus Blood serum FBS)的DMEM培养基洗脱(Dimethylsulfoxide DMSO)，时间为10分钟，最后去除洗脱液。染色固定，首先将0.4％茜素红数滴加入角膜片的内皮面上，染色3分钟后用生理盐水漂洗；其次用0.25％苔盼蓝数滴再加入到内皮面上染色2分钟后，再用生理盐水漂洗<'[4,5]>；再次用2.5％戊二醛2ml浸泡角膜片固定10分钟后，再用生理盐水漂洗。最后在显微镜下检查角膜内皮细胞的存活率，以角膜片中央四个不同视野为标准，最后通过统计学处理，已α=0.05为标准，P<0.05为有统计学意义。结果对照组即未经过冷冻处理的新鲜兔角膜片显微镜检查可见内皮细胞排列整齐，紧密连接，茜素红和苔盼蓝联合染色法可见细胞呈现红色的六边形轮廓，未见到染为蓝色的细胞核，细胞间隙未见增大，整个视野中可见角膜内皮细胞大小一致形态完整。而实验组即经过各种不同冷冻程序处理的角膜片经过显微镜检查可发现，细胞间隙均有所增大，有些细胞排列仍然整齐，但细胞轮廓大多呈现圆形或不规则形状，但其余很多方法冻存的细胞排列已经不规整，形态不清，细胞边界不存在，细胞间隙明显增大，而且可见到许多染为蓝色的细胞核，有些照片可见两三个细胞融合，有些部分细胞成片缺失，甚至可见大片融合的细胞，整个视野仅残留裸核。
经过大量的对比实验研究，发现在第一阶段降温速度为2℃/min时和第二阶段降温速度为5℃/min时角膜内皮细胞的存活率达到最高，而其它多种方法中可见染为蓝色的细胞核或者大片融合的细胞，仅残留蓝色的裸核。第一阶段的降温速度V<,1>在-2.0℃/min与其它六种速度比较，P值均<0.05；第二阶段的降温速度V<,2>在-5℃/min与其它六种速度比较P值均<0.05，均有统计学意义。
结论
角膜深低温冷冻保存过程的复杂和程序控降温仪器的昂贵都限制了更多眼库的开展，本人经过大量的实验证明，在条件具备的基础上经过严格的程序设定和操作过程都能保证深低温冷冻保存的角膜内皮细胞其存活率能达到70％以上，有利于在眼库的开展采用。
角膜;内皮细胞;深低温冷冻保存
郑州大学
硕士
眼科学
王丽娅
2007
中文
R772.2
38
2007-08-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）