人脐静脉内皮细胞移植治疗角膜内皮衰竭的实验研究
目的：角膜内皮疾病如大泡性角膜病变、Fuchs角膜内皮营养不良、内眼手术后内皮失代偿等是导致角膜混浊和视力下降的重要原因。每年全世界约有100万以上的患者因为角膜内皮功能失代偿而导致失明，目前唯一有效的治疗方法是穿透性角膜移植术。虽然该术式成功率较高，但由于供体角膜缺乏、术后排斥反应、角膜供体老龄化等原因而受到限制。组织工程化角膜是当今眼科领域的研究热点，而亟待解决关键问题之一是如何构建角膜内皮组织。人们尝试多种方法培养角膜内皮细胞，但因受到供体角膜缺乏，载体稳定性差，手术操作中易破碎等因素限制，至今仍无法应用于临床。为寻求一种不依赖于供体角膜而构建角膜内皮组织的有效方法，本实验首次取人脐静脉内皮细胞(Human umbilical veinendothelial cell，HUVEC)进行体外培养扩增，代替有限的角膜内皮细胞，并以异种脱细胞角膜基质为载体进行后板层角膜移植(Posterior lamellarendothelial keratoplasty，PLEK)治疗机械性损伤所致的兔角膜内皮衰竭，通过与单纯脱细胞角膜基质移植及单纯去除内皮进行对比，探讨异种脱细胞角膜基质培养人脐静脉内皮细胞移植治疗角膜内皮衰竭的可行性。
方法：1．动物模型：30只新西兰白兔(2.5～3kg)，麻醉后沿左眼角膜缘切开270°，显微镜下全角膜范围去除角膜内皮细胞，建立机械损伤所致的内皮衰竭动物模型。将动物模型随机分为3组，实验组、基质组和对照组，每组10只动物，4周后实验组和基质组行后板层角膜移植术。2．载体制备：取猪角膜全层，制成直径为7.5 mm、厚约0.1mm板层角膜片，以Triton-胰蛋白酶联合方法进行脱细胞处理，对脱细胞基质进行HE染色，观察细胞是否去除完全。3．细胞培养：采用0.1﹪胶原酶Ⅰ灌流消化法获取人脐静脉内皮细胞，用含有20﹪胎牛血清和10ng/ml VEGF的DMEM/F12(1:1)培养基进行原代培养5～7天，当细胞达到80﹪～90﹪融合生长时进行消化传代。将第二代细胞以2×10<'6>个/cm<'2>密度接种于制备好的脱细胞角膜基质上继续培养，倒置显微镜进行形态学观察，一周时细胞在脱细胞角膜基质上生长成完整单层后用于移植。4．移植手术：做直径为9 mm、3/4角膜厚度的带蒂前层角膜瓣并掀置一侧，再用直径7.25 mm的环钻钻去中央后部1/4层角膜，形成植床，将植片置于植床，8-0可吸收线间断缝合，10-0尼龙线：间断缝合前层角膜瓣，术后观察3个月。结果：培养皿中及脱细胞角膜基质上培养的细胞均在24小时完成贴壁，开始为短梭形或多角形，一周时形成单层，细胞呈“铺路石样”外观，大小一致，排列紧密。脱细胞角膜基质为半透明薄片，组织学观察细胞结构完全消失，纤维支架保存良好，排列疏松。术后3个月时，实验组兔角膜水肿程度较基质组和对照组明显减轻，透明度增加，内皮细胞密度为(2026.4±129.3)个/mm<'2>，中央角膜厚度平均为(505.2±25.4)μm，基质组中央角膜厚度平均为(1535.6±114.5)μm，而对照组为(1493.5±70.2)μm。
结论：本实验成功分离培养出人脐静脉内皮细胞，并将其培养于脱细胞角膜基质上，为构建角膜内皮样组织以及移植提供了较为理想的载体。实验以异种脱细胞角膜基质为载体培养人脐静脉内皮细胞，行后板层角膜移植术，治疗角膜内皮衰竭取得了初步成功。移植的人脐静脉内皮细胞能够在活体上成活，并具有一定的角膜内皮细胞的生物学功能，维持角膜透明，为临床上治疗角膜内皮疾病提供了新的思路和方法。
人脐静脉内皮细胞;细胞角膜;角膜移植;角膜内皮衰竭;角膜混浊
大连医科大学
硕士
眼科学
马翔
2007
中文
R772.2
28
2007-08-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）