诱导型一氧化氮合成酶在糖尿病大鼠晶状体上皮细胞凋亡中表达的研究
目的：一氧化氮(NO)是组织内常见的氧化自由基，高度活跃。少量NO可以维持机体正常的生理需求。而大量的NO会对组织细胞造成氧化损伤。一氧化氮合成酶(NOS)是体内主要的NO合成限速酶，分为Ⅲ型：Ⅰ和Ⅲ型受细胞内Ca<'2+>的调节，催化生成少量NO，维持机体需要。Ⅱ型又称诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，在一定的刺激下，才被激活，催化生成NO。本实验应用链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱导糖尿病大鼠模型，观察iNOS在糖尿病大鼠晶状体上皮细胞中的表达情况，以及iNOS的表达与细胞凋亡酶一半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)之间的关系。并用胰岛素(INS)进行干预治疗，旨在探讨iNOS在糖尿病性白内障病变过程中的作用，并为临床用药提供理论及实验依据。
方法：选择体重在200±10g，健康无热源并无眼疾的雄性sprague-Dawlve(SD) 大鼠40只，并随机分为6只正常组大鼠和34只糖尿病模型组大鼠。适应性喂养3天，34只糖尿病模型组大鼠禁食，自由饮水24小时后，采用腹腔内注射sTZ(55mg/kg)诱导糖尿病大鼠模型，3天后采尾静脉血，确认血糖≥16mmol/L，多饮、多食、多尿为造模成功。34只随机分为糖尿病组10只；治疗组10只；对照组10只。(其中2只血糖未达到标准，2只由于血糖过高，死于并发症，未加入实验)。糖尿病组大鼠和正常组大鼠正常喂养；治疗组大鼠每天皮下注射INS(10单位/kg)；对照组大鼠每天皮下注射PBS缓冲液(1ml/kg)。整个实验过程中用裂隙灯显微镜观察大鼠晶状体的形态学变化。分别在造模成功后的第4周、8周，分别处死每组的5只动物(正常组3只动物)。取一侧晶状体做电镜切片观察晶状体上皮细胞超微结构的变化。取另一侧晶体固定后，做病理切片及用免疫组化的方法测定各组晶状体上皮细胞中不同时段iNOS、3-硝基酪氨酸(3-NT)、Caspase-3在蛋白水平的表达。用Image-pro Plus软件对免疫组化显色结果进行拍照、灰度分析。应用SPSS13.0软件，采用单因素方差分析和配对t检验的方法，做统计学的分析。视P<0.05，有统计学意义。结果：
1．光镜：正常组大鼠晶状体上皮细胞形态未见明显的变化。糖尿病组大鼠晶状体上皮细胞出现明显的细胞排列紊乱，胞核边集等细胞凋亡的表现。治疗组的变化较糖尿病组明显减轻。对照组的变化同糖尿病组。
2．电镜：正常组大鼠的晶状体上皮细胞的细胞核、细胞器(线粒体)及细胞间连接未见明显的变化。糖尿病组大鼠晶状体上皮细胞的细胞核出现核固缩、线粒体肿胀，细胞间连接疏松，明显细胞凋亡的表现。治疗组的变化较糖尿病组明显减轻。对照组的变化同糖尿病组。
3．免疫组化：
(1)正常组大鼠晶状体上皮细胞中无iNOS表达。在持续高血糖的状态下，大鼠晶状体上皮细胞开始出现iNOS的表达。
(2)随着iNOS表达的增加，细胞中NO的含量增加，NO使细胞中的酪氨酸硝基化，生成3-NT，对细胞产生毒性作用。同时细胞中凋亡核心酶—Caspase-3被激活，表达逐渐增加，引起细胞凋亡的级联反应。
(3)在控制血糖后，iNOS的表达明显降低，随之Caspase-3的表达减低，细胞凋亡减少。糖尿病组各个因子的表达与治疗组和正常组统计学分析P<0.05，有统计学意义。糖尿病组各个因子与对照组统计学分析P>0.05，无统计学意义。
结论：持续高血糖状态下，诱导型一氧化氮合成酶在晶状体上皮细胞的凋亡中可能起着重要的作用。
糖尿病性白内障;晶状体上皮细胞;细胞凋亡
大连医科大学
硕士
眼科学
邵彦
2007
中文
R776.1
33
2007-08-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）