人羊膜上皮细胞移植治疗角膜缘干细胞缺损的实验研究
目的角膜缘干细胞缺损时，角膜上皮细胞不能自我更新，结膜上皮侵入角膜表面，这种结膜化的过程会使角膜上皮变得异常且不规则，并伴有继发的新生血管化，持续的上皮缺损，基质溃疡，瘢痕化，潜在的穿孔，慢性疼痛及视力丧失。角膜缘干细胞缺损的治疗非常棘手。以抑制炎症反应、防止感染、减少睑球粘连等为目的的保守疗法和传统的穿透或板层角膜移植等手术治疗方法的效果均很差。角膜缘干细胞移植被认为是一种促进角膜损伤愈合，稳定角膜表面，修复角膜上皮糜烂和持续性上皮缺损，减少角膜新生血管侵入，阻止假性胬肉形成，增进视力，提高角膜移植成功率的有效方法。自体角膜缘移植不存在免疫排斥反应，术后效果好，但只适用于单眼角膜缘受损或双眼局限性受损的患者，临床应用有一定的局限性。同种异体角膜缘移植存在免疫排斥反应，常致手术失败。
羊膜上皮细胞(Amniotic epithetical cells)是胚胎发育的早期产物，所以其中可能含有多潜能干细胞。保存羊膜的上皮细胞已经死亡，新鲜羊膜的上皮细胞与基底膜结合紧密，两者都不易发挥其干细胞的功能，于是我们将人羊膜上皮细胞分离并于体外进行大量增殖培养，并以去上皮羊膜为载体移植治疗兔角膜碱烧伤所致的角膜缘干细胞缺损，通过与单纯去上皮羊膜移植比较治疗效果，探讨该手术方法的安全性和有效性，为严重角膜缘干细胞缺损的临床治疗提供新的思路。
方法碱烧伤模型的制作方法参照’Fseng等人建立的方法进行改进，通过板层切除角膜缘联合NaOH烧伤角膜来达到制作目的。羊膜经EDTA处理后去除其上皮细胞。分离，去除残留的绒毛膜，PBS洗尽血迹后用0.125﹪胰酶(typsine)37℃消化15分钟，重复4次，1000rpm离心6分钟收集羊膜上皮细胞，用PBS洗三次后接种在含DEME培养皿中，于3 7℃含5﹪二氧化碳的培养箱内培养。细胞培养两周后接种于去上皮羊膜上，常规培养两周后行移植手术。将单眼碱烧伤模型兔18只随机分为对照组(control group)，单纯羊膜移植组(AM group)和人羊膜上皮细胞羊膜移植组(AM+cell group)，每组6只兔6眼，移植手术于烧伤后四周进行，并对治疗后的角膜进行裂隙灯观察，病理学和免疫组化检测。
结果消化、分离的HAECs于2-3天内贴壁，15×15cm<'2>大小的羊膜大约可以收获1×10<'6>个细胞。贴壁生长的羊膜上皮细胞一般成簇生长，呈圆形、多角形，核较大，胞浆中含有特征性的空泡状的脂肪滴。2—3周传代一次．人羊膜上皮细胞羊膜移植组治疗后角膜基本保持透明，新生血管细小，未见结膜上皮长入；病理学检查可见与正常角膜类似的复层上皮，未见明显的杯状细胞和新生血管；AE-5染色阳性。单纯去上皮羊膜移植治疗后角膜混浊，结膜上皮长入，新生血管较粗大多见；病理学检查可见排列不规则的复层上皮细胞，夹杂较多杯状细胞，可见炎性细胞，红细胞和新生血管，AE-5染色阴性。对照组大部分角膜上皮脱落，杯状细胞弥漫分布，炎性细胞浸润，大量新生血管向角膜中央生长，AE-5阴性。
结论采用消化培养法可获得人羊膜上皮细胞。通过板层切除角膜缘联合氢氧化钠烧伤角膜可以建立角膜缘干细胞缺损的动物模型。本实验发现人羊膜上皮细胞移植术后早期就可恢复角膜上皮的完整性，抑制角膜新生血管形成，为治疗严重角膜缘干细胞缺损眼表疾病提供了新的思路。由此推测可以将人羊膜上皮细胞体外培养增殖，移植进行眼表重建，从而治疗由于各种原因引起的角膜缘干细胞缺损。
角膜缘干细胞;羊膜上皮细胞;细胞培养;胚胎发育;干细胞
大连医科大学
硕士
眼科学
马翔
2007
中文
R772.2
32
2007-08-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）