梯度材料骨髓间充质干细胞构建组织工程骨-软骨的研究
目的：本实验旨在应用组织工程原理和技术，利用PLA、壳聚糖、胶原研制三维多孔、双性能的骨-软骨复合梯度支架材料；探讨材料的生物相容性、体内降解性能，以及材料对细胞生长可能产生的作用；并进行体外组织工程骨-软骨构建和生物体内原位骨-软骨诱导再生研究。
方法：借助超临界二氧化碳循环法研制壳聚糖生物/聚乳酸/胶原三元多孔复合梯度支架材料，构建不同强度、不同孔径和孔隙率的梯度材料；对支架材料进行动物体内生物相容性和降解试验；采用全骨髓分离培养法，体外进行兔骨髓基质干细胞(BMSC)诱导转化为软骨细胞，并与梯度材料共同培养，构建带骨支架的软骨复合体；将复合体植入新西兰兔体内，原位诱导骨-软骨再生，修复关节软骨缺损。对实验结果进行组织学、免疫组化、超微结构等检测。
结果：1、SC-CO2反复循环法制备的PLA/壳聚糖/胶原的梯度支架材料的具有明显的梯度结构，支架材料的开孔率可以比传统的一次性升压法明显提高，其孔隙结构与孔隙率适宜软骨细胞的种植；梯度材料的生物力学强度、孔隙率、孔径达到了软骨细胞体外生长和体内原位再生的要求；2、全骨髓分离培养法在体外完成了兔MSCs的分离、扩增、传代，MSCs体外诱导向软骨细胞诱导分离3周后，培养出软骨组织块，经HE、Alcianblue染色，可见软骨细胞扩增、传代，并有细胞外基质分泌；免疫组化检测提供了依据，RT-PCR显示有Ⅱ型和Ⅹ型胶原表达，提示细胞所分泌的基质为Ⅱ型胶原，分泌物形成了透明软骨。透射电镜见软骨细胞在材料内呈贴壁生长，基质大量分泌，兔骨髓基质干细胞体在软骨诱导剂和离心培养条件下可成功生成软骨组织，初步构建成功带骨支架的软骨细胞复合体；3、PLA/壳聚糖/胶原支架材料体内组织学观察发现，降解的材料周围可见少量炎症细胞，表明PLA/壳聚糖/胶原在体内的降解产物可能引起轻度的炎症反应，但对组织工程骨软骨的生长发育无明显抑制。组织炎症12周后，基本消失；提示材料组织相容性能良好；4、超微结构显示，细胞在支架材料孔隙内壁良好的附着、生长、扩增并形成软骨样组织，细胞分布均匀，提示体外三维培养的细胞-支架复合物能形成了软骨样组织；5、细胞-支架复合物植入同种异体新西兰兔股骨髁12周后，骨和软骨两部分整合为一个整体，形成了结合良好的骨-软骨组织，修复了直径3mm的兔关节软骨缺损。
结论：1、超临界二氧化碳反复循环萃取法可用于制备具有明显的梯度结构、生物力学强度、孔隙率、孔径符合软骨细胞体外生长和体内原位再生要求的组织工程支架材料；2、实验所采用全骨髓分离培养的方法，BMSCs作为种子细胞，在软骨诱导剂诱导下，可以在体外完成兔MSCs的分离、扩增、传代，并构建软骨组织块；而未添加软骨诱导剂的骨髓间充质干细胞不能分化成软骨细胞；PCR显示有Ⅱ型和Ⅹ型胶原表达，提示兔骨髓基质干细胞体在软骨诱导剂和离心培养条件下可转化软骨组织；3、由MSCs诱导、传代后的第二～三代的软骨细胞可以在PLA/壳聚糖/胶原三维梯度支架材料上贴壁生长，并分泌细胞外基质，初步构建出含软骨细胞的组织工程骨-软骨复合体；4、PLA/壳聚糖/胶原支架材料组织炎症反应轻微，其组织相容性能良好；材料体内降解速率达到设计要求；5、初步认为，实验所构建出含软骨细胞的组织工程骨-软骨复合体具有原位诱导骨-软骨再生的能力。6、实验研制的PLA/壳聚糖/胶原三维多孔生物降解的梯度支架材料具有良好的空间结构和细胞相容性，有望成为骨软骨组织工程的理想的支架材料。
梯度材料;软骨组织工程;骨髓间充质干细胞;壳聚糖;聚乳酸
暨南大学
博士
生物医学工程
周长忍
2006
中文
R318;Q954.657
160
2007-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）