生长抑素2型受体的核素报告基因显像和对胰腺癌抑制作用的研究
背景与目的：生长抑素是一种在人体中广泛分布的激素，通过靶细胞膜上的生长抑素受体(somatostatinreceptor，SSTR)介导，负性调节多种生理功能。SSTR共有5种亚型，其中2型受体(somatostatinreceptor2，SSTR2)被认为与肿瘤的关系最为密切。生长抑素或生长抑素类似物可通过SSTR2抑制肿瘤细胞的增生。胰腺癌中SSTR2表达缺失或是低表达，导致SSA治疗胰腺癌的效果不佳。通过基因转移的方法，将SSTR2基因导入肿瘤细胞内，通过SSTR2在细胞表面的再表达可以进行基因治疗。为评价基因治疗，需要随时对治疗基因的定位和表达进行监测，随着分子影像学的发展，可以利用放射性核素报告基因显像技术探测基因治疗中治疗基因表达情况。报告基因是监测治疗基因表达的外源基因，SSTR2可作为报告基因，利用放射性核素标记的生长抑素类似物进行显像，通过SSTR2基因的表达情况来间接评价治疗基因的表达情况。在SSTR2基因治疗胰腺癌的过程中，SSTR2既是报告基因，又是治疗基因。为此，本研究以SSTR2为报告基因，建立放射性核素锝标记奥曲肽(99mTc-奥曲肽)在胰腺癌基因治疗中的报告基因表达显像的方法，为胰腺癌基因治疗的疗效监测提供新的途径，观察SSTR2基因对裸鼠人胰腺癌移植瘤生长的影响，并以调控肿瘤生长的关键基因为靶点，对其影响机制作初步探讨。
方法：①构建重组腺病毒穿梭质粒pDC316-SSTR2和pDC316-LacZ，分别通过脂质体与腺病毒骨架质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre共转染293细胞，经位点特异性重组获得重组腺病毒Ad-SSTR2和Ad-LacZ，并通过PCR鉴定Ad-SSTR2和Ad-LacZ，再经293细胞扩增，纯化制备高滴度病毒感染液，用X-gal染色法测定重组腺病毒感染能力。②以病毒感染液感染人胰腺癌细胞capan-2，应用RT-PCR、Westernblot和免疫细胞化学方法检测SSTR2mRNA和蛋白的表达。③MTT法检测Ad-SSTR2对capan-2细胞生长的影响。④SD大鼠经静脉注射99mTc-奥曲肽后，在不同时间内显像并测定心血池放射性计数，计算奥曲肽血药浓度，进行药代动力学分析。⑤提取Ad-SSTR2转染后的capan-2细胞膜蛋白，用99mTc-奥曲肽作亲和配基，进行受体饱和实验和竞争抑制实验。⑥用RT-PCR和Westernblot检测肺癌，鼻咽癌，宫颈癌，肝癌，乳腺癌，胰腺癌6种肿瘤，共12株细胞SSTR2mRNA和蛋白的表达。⑦免疫组化和Westernblot检测Ad-SSTR2和Ad-LacZ在裸鼠胰腺癌组织中的表达。⑧Ad-SSTR2转染荷瘤裸鼠胰腺癌48h后，尾静脉注射99mTc-奥曲肽，单光子发射计算机断层(singlephotonemissioncomputedtomography，SPECT)进行SSTR2显像，并进行99mTc-奥曲肽生物分布分析。⑨建立裸鼠人胰腺癌移植瘤模型，分别瘤内注射生理盐水(阴性对照组)、Ad-LacZ(报告基因对照组)和Ad-SSTR2(实验组)，观察肿瘤大小和重量变化，将肿瘤组织制成单细胞悬液，流式细胞术检测细胞周期。⑩Westernblot检测3组肿瘤组织p16、p21、Bax、Bcl-2、caspase-3、p53、survivin、ERK2、ras、VEGF、TIMP-2和PARP-1的蛋白表达水平。
结果：①成功构建腺病毒穿梭质粒pDC316-SSTR2和pDC316-LacZ，与pBHGloxdeltaE1,3Cre共转染293细胞获得了重组腺病毒Ad-SSTR2和Ad-LacZ，以Ad-SSTR2基因组DNA为模板同时扩增出了人SSTR2cDNA基因片段和腺病毒骨架基因片段；Ad-SSTR2和Ad-LacZ经扩增、纯化后，病毒滴度分别为6.0×109pfu/ml和6.5×109pfu/ml；Ad-SSTR2对capan-2细胞具较高感染能力，感染复数(multiplicityofinfection，MOI)为100时感染效率达100﹪。②Ad-SSTR2感染capan-2后，RT-PCR检测到SSTR2mRNA的表达，Westernblot和免疫细胞化学检测到SSTR2蛋白的表达。③Ad-SSTR2对capan-2细胞的生长除病毒毒性作用外，SSTR2基因具有一定程度的细胞增殖抑制作用。④99mTc-奥曲肽在血中迅速进入器官组织，主要经尿路排泄，药代动力学符合二室开放模型，t1/2a=4.8min，t1/2β=693min。⑤Ad-SSTR2转染后的capan-2细胞膜受体能与99mTc-奥曲肽特异性结合，平衡解离常数KD=1.12×10-10mol/L，最大受体结合容量Bmax=7.0×10-11mol/L=2.1×1012结合位点/μg蛋白质，半数抑制浓度IC50=5.8×10-10mol/L。⑥除1株肺癌细胞外，其余11株细胞都表达SSTR2mRNA；有1株肺癌细胞，2株胰腺癌细胞不表达SSTR2蛋白。⑦Ad-SSTR2和Ad-LacZ转染荷瘤裸鼠胰腺癌后，表达β-半乳糖苷酶和SSTR2蛋白。⑧荷胰腺癌裸鼠尾静脉注射99mTc-奥曲肽3h后，SPECT显像显示Ad-LacZ转染后肿瘤不显像，Ad-SSTR2转染后肿瘤显像清晰，它对99mTc-奥曲肽的吸收比转染Ad-LacZ的肿瘤高5倍。⑨Ad-SSTR2转染后，对裸鼠胰腺癌移植瘤生长具有抑制作用，抑制率为48.2﹪，SSTR2阻断细胞周期于G0/G1期。⑩SSTR2上调周期调控蛋白p16、促凋亡蛋白酶caspase-3的表达，下调信号转导通路蛋白ras和ERK2、血管生成因子VEGF、凋亡抑制因子survivin、caspase-3底物PARP-1的表达，对p21、Bax、Bcl-2和p53的表达无影响。
结论：①成功构建携带人SSTR2基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-SSTR2，经大量扩增和纯化获得高滴度病毒感染液，并在胰腺癌细胞中得到正确表达，为SSTR2基因治疗胰腺癌和放射性核素报告基因显像监测胰腺癌基因治疗效果提供了一有用工具。②建立了用核素显像来研究标记奥曲肽在体内药代动力学的技术，为开展活体的SSTR2SPECT显像奠定了基础。③首次在荷胰腺癌裸鼠模型上建立了99mTc-奥曲肽进行SSTR2报告基因显像的技术，用该技术来监测基因治疗中治疗基因的表达具有可行性。④腺病毒载体介导的SSTR2基因对裸鼠胰腺癌移植瘤生长具有一定的抑制作用，其作用机制与上调周期调控蛋白p16和促凋亡蛋白酶caspase-3，下调信号转导通路蛋白ras和ERK2、肿瘤血管生成因子VEGF、凋亡抑制因子survivin有关，提示SSTR2基因治疗可能会成为治疗胰腺癌的一条有效途径。
生长抑素;腺病毒;基因治疗;放射性核素显像;报告子;胰腺肿瘤
暨南大学
博士
生物医学工程
周天鸿
2006
中文
R318
128
2007-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）